《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Integrated dual-molecular marker analysis with SSR and UPLC-Q-TOF/MS fingerprints technology reveal the interrelation of the molecule-metabolite in
Morus alba L. leaves
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本研究针对不同品种桑叶遗传多样性、代谢物组成与药理活性间关联不清的问题，研究人员整合SSR分子标记与UPLC-Q-TOF/MS代谢物分析技术，构建69批桑叶样品的多维指纹图谱，发现品种差异显著影响解热功效，并筛选出7个SSR核心位点及8个关键化学标志物，为桑叶品种精准鉴定和高价值资源利用提供科学依据。
桑树（Morus alba L.）作为一种原产于中国的古老植物，拥有超过5000年的栽培历史，其叶片不仅是中国传统中药的重要组成，也被广泛用于食品和饲料领域，具有显著的生态、经济和社会价值。中国拥有丰富的桑树种质资源，不同品种在农艺性状、生理代谢和药理活性上表现出巨大的多样性。尤其值得注意的是，桑叶作为临床应用最广泛的中药部位，历史上被记载具有解热和抗炎的特性。然而，尽管这种多样性被认识到，但不同桑叶品种在解热功效上的差异尚未有系统研究。更为关键的是，遗传多样性、代谢物谱和解热活性之间的内在联系仍不明确，这严重制约了桑叶优质种质资源的筛选、育种以及其在临床上的精准应用。
为了解决上述问题，一项发表在《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》上的研究开展了一项系统性的工作。研究人员从山东省不同地点收集了23个主要栽培品种（共69批次）的桑叶样品。研究团队首先利用大鼠药效学模型评估了不同品种桑叶的解热效果。接着，他们采用TP-M13-SSR分子标记技术构建了桑叶的简单序列重复（SSR）指纹图谱，以筛选用于品种鉴定的核心引物对。同时，利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术建立了桑叶的代谢物指纹图谱，对共有峰进行了校准，并通过质谱对化合物进行了定性鉴定。最后，应用多变量化学计量学方法整合SSR数据、UPLC-Q-TOF/MS指纹图谱数据以及解热活性结果，进行聚类分析和相关性分析，旨在揭示“功效-分子-代谢物”之间的内在关联。
3.1. 不同品种桑叶的解热效果分析
解热曲线显示，不同桑叶品种的解热功效存在显著差异。通过层次聚类分析，23个桑树种质资源的解热数据被分为2组。研究发现，烟台792、浙桑3号、8036、丰源1号、莱芜古桑、夏津古桑、高青792、浙桑1号和黑珍珠这9个品种表现出最强的解热活性，并被聚在同一组。值得注意的是，来自不同地理起源的“古桑”和“792”品种都聚集在同一组，这表明品种差异对解热功效的影响比地理起源差异更为显著。另一方面，桂优、丹白桑和大石表现出相对较弱的解热功效，被聚类到另一组。这种功效差异可能与特定代谢物的双向调节作用有关，即某些代谢物浓度过高可能会影响整体药效，这符合中药“平和之药不宜过量”的理论。
3.2. SSR指纹图谱分析
研究人员从22对TP-M13-SSR引物中筛选出7对（TP1, TP2, TP3, TP5, TP7, M2, M10）具有高多态性、稳定性和重复性的引物，用于69份桑叶样品的基因分型和遗传多样性分析。多态性分析显示，这7对引物的观测等位基因数（Na）平均为4.7143，有效等位基因数（Ne）平均为2.8986，Shannon多样性指数（I）平均为1.1569，多态信息含量（PIC）平均为0.5585，表明所选引物在23个种质资源中表现出高多态性，适合作为品种鉴定的核心标记组合。
基于Nei's (1972)遗传相似系数的分析显示，23个桑叶种质资源间的遗传相似系数在0.118到1.000之间。其中，桂优（S1）和丹白桑（S19）之间，以及烟台792（S7）和强桑（S8）之间具有最高的遗传相似系数。研究人员还利用等位基因赋值法为每个种质资源构建了独特的分子身份证（Molecular ID），结果发现S1桂优和S19丹白桑共享相同的分子ID代码，S7烟台792和S8强桑也共享相同的ID代码，这与遗传系数结果相互印证。
通过UPGMA法进行的亲缘关系聚类分析将23个种质资源在遗传相似系数阈值0.43处分为两大组。组I包含S1桂优、S19丹白桑和S20大石，组II包含其余20个种质资源。
3.3. 桑叶的UPLC-Q-TOF/MS分析
方法学验证表明，所建立的UPLC-Q-TOF/MS方法精密度、重复性和稳定性良好。通过分析总离子流图，结合数据库和文献报道，研究人员鉴定了桑叶中的主要分子离子峰，并建立了包含21个共有峰的UPLC-Q-TOF/MS指纹图谱。相似度评价显示，不同品种桑叶样品之间的相似度值在0.602到0.870之间，表明不同品种桑叶的代谢物存在差异。
以21个共有峰的标准化峰面积为变量进行聚类分析生成的热图显示，S1桂优的代谢物积累水平与其他样品差异显著，单独聚为一类。S19丹白桑和S20大石的代谢物谱较为相似，而S23夏津古桑中的第15号峰强度明显高于其他样品。基于UPLC-Q-TOF/MS指纹图谱的聚类分析同样将23个种质样品分为2大类，S1桂优、S19丹白桑和S20大石被聚到第I类，其余为第II类。
主成分分析（PCA）提取出6个特征值大于1的主成分，累计方差贡献率达85.238%，能够代表21个共有峰的大部分信息。载荷矩阵分析揭示了各变量对主成分的贡献，其中峰11和峰16-21对主成分1（PC1）贡献较大。
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型的累积解释能力参数R2X为0.593，R2Y为0.974，预测能力参数Q2为0.818，模型验证表明模型稳定且预测能力强，未出现过拟合。通过变量重要性投影（VIP）值（VIP > 1.0）结合质谱鉴定数据，筛选出隐绿原酸（cryptochlorogenic acid）、新绿原酸（neochlorogenic acid）、异槲皮苷（isoquercitrin）、芦丁（rutin）、烟花苷（nicotiflorin）、紫云英苷（astragalin）、水杨酸（salicylic acid）和伞形酮（umbelliferone）这8个作为桑叶品种鉴定的关键化学标志物。这些化合物可能是桑叶发挥解热作用的多靶点、多途径物质基础。
3.4. 皮尔逊相关系数分析
皮尔逊相关系数分析和Mantel检验用于分析分子-代谢物以及功效-分子-代谢物之间的相关性热图。结果显示，在功效-分子-代谢物相关系数图中，分子谱与代谢物谱之间存在显著的正相关关系，这进一步证实了分子水平特征、代谢物和药理效应之间潜在的相关性。对特定品种组合的分析揭示了复杂的正负相关模式，这些模式与种质的起源、品种分类、遗传相似性以及栽培环境等因素密切相关。
3.5. 功效-分子-代谢物关联分析
对SSR和UPLC-Q-TOF/MS指纹图谱结果的联合分析表明，这23个桑树种质资源在亲缘关系和代谢物聚类模式上既存在相似性，也存在差异性。桂优、丹白桑和大石这三个品种在分子聚类、代谢物聚类和解热聚类图中均被聚在一起，并且其代谢物及含量具有可比性，解热动物实验也显示它们聚为一组。浙桑1号和浙桑3号，以及莱芜古桑和夏津古桑表现出积极的解热效果，它们在所有分子聚类、代谢物聚类和解热聚类图中均可聚为一类，并且在“功效-分子-代谢物”相关系数图中也显示出显著的正相关。这表明桑叶品种的差异导致了遗传特征、代谢物和药理作用的差异。由于同一品种内没有显著的遗传差异，其代谢物和药理作用相对相似，因此推测它们的遗传成分、化学谱和药理活性之间存在潜在关联，化学和分子组成标记可能反映功效的优劣。
4. 结论
本研究成功建立了69批次桑叶品种的SSR指纹图谱、UPLC-Q-TOF/MS指纹图谱和解热聚类图，并系统分析了“功效-分子-代谢物”之间的相关性。多变量化学计量学方法鉴定出烟台792、浙桑3号、8036、丰源1号、莱芜古桑、夏津古桑、高青792、浙桑1号和黑珍珠为解热活性强的优势品种，而桂优、丹白桑和大石功效较弱，在分子-代谢物-功效图中聚为一类，凸显了品种差异对遗传多样性、代谢物组成和药理作用的显著影响。相关性分析进一步揭示了遗传成分、代谢物和药理效应之间的正相关关系。最终，研究筛选出包含7个SSR位点的核心标记集以及隐绿原酸、新绿原酸、异槲皮苷、芦丁、烟花苷、紫云英苷、水杨酸和伞形酮这8个关键化学标志物，作为偏向解热功效的桑叶“分子-代谢物”双分子标记。
这项研究通过整合DNA分子标记和次级代谢物分析策略，形成了桑叶的协同鉴定体系。DNA分子标记用于区分不同来源的桑叶，而次级代谢物则用于评估质量并确定其活性成分含量，这种组合克服了单一标记的局限性，能够同时实现物种鉴定和质量评价，为中药材提供了全面的质量鉴定身份证。该研究为建立桑叶品种“分子-代谢物”标记的高通量鉴定模型提供了有价值的参考，同时也为深化桑叶的药用价值和促进高价值资源利用提供了理论支持。
