基于Cd-dpac和MOF-199（表面修饰有AuNPs）的敏感三明治型电化学免疫传感器，用于检测CA19-9

《Microchemical Journal》：Sensitive sandwich-type electrochemical immunosensor based on Cd-dpac and MOF-199 decorated with AuNPs for CA19-9 detection

胰腺癌早期筛查依赖CA19-9检测，本研究开发夹心式电化学免疫传感器（AuNPs/Cd-dpac与AuNPs/MOF-199复合体系），通过优化Cd-dpac合成与MOF-199金纳米颗粒负载，实现0.001-100 U/mL宽线性范围，检测限0.06×10?2 U/mL，血清回收率90.78%-109.80%，验证复杂生物基质中检测可靠性，并拓展至其他生物标志物检测。

　　

张欣|蒲凤英|徐永奇|吴双燕|孙亚光|孙启宇|张颖|林琳|朱明昌

中国辽宁省无机分子基化学国际重点实验室及沈阳化工技术大学配位化学系，沈阳 110142

摘要

碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是一种在临床实践中常规检测的血清肿瘤标志物，主要用于筛查消化系统癌症。在胰腺癌领域，这一标志物具有关键意义。因此，开发高灵敏度的CA19-9检测方法是一项具有挑战性的任务。本研究报道了一种用于检测CA19-9的夹心型电化学免疫传感器（ECI）。该ECI采用AuNPs/Cd-dpac作为电极界面，AuNPs/MOF-199作为二次抗体（Ab₂）的探针，其中Cd-dpac由2,6-二(3,5-二羧基苯基)-4-乙酰氨基苯甲酸和Cd(NO?)?·6H?O合成。在这种设计中，Cd-dpac不仅为免疫传感器提供所需的信号，还具有层状结构，从而获得较大的比表面积以容纳更多的生物大分子分析物；此外，MOF-199利用其多孔性来增强Ab₂的负载能力并促进信号放大。AuNPs在Cd-dpac和MOF-199表面的均匀负载进一步提高了电化学传感器的导电性，从而提升了灵敏度。在检测过程中，当目标CA19-9存在时，夹心型免疫传感器会引发特定的免疫反应。该电化学传感器的信号在0.001–100?U/mL的浓度范围内表现出优异的性能，检测限为0.06?×?10^?2?U/mL。血清样本的回收率在90.78%到109.80%之间，证实了该传感器在复杂生物基质中的实际应用价值。这一传感平台具有多功能性，通过更换识别元件可以用于检测其他生物标志物。

引言

胰腺癌是最致命的人类恶性肿瘤之一，其死亡率几乎与其发病率相当[1]。这一高死亡率引起了全球的关注，加强胰腺癌的早期筛查、诊断和治疗研究是目前减少患者负担和改善预后的关键[2]、[3]、[4]。碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是一种在临床实践中常规检测的血清肿瘤标志物，主要用于筛查消化系统癌症。在胰腺癌领域，这一标志物具有关键意义[5]。从结构上看，CA19-9是一种与细胞表面黏蛋白MUC1相关的唾液酸化Lewis抗原，平均分子量为1000?kDa。在健康个体中，血清CA19-9水平通常低于37?U/mL，而在胰腺癌患者中则显著升高[6]、[7]。因此，精确检测CA19-9对于胰腺癌的及时诊断具有重要意义。

迄今为止，已经开发了多种分析技术用于检测CA19-9，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]、表面增强拉曼散射（SERS）[9]、荧光[10]和光致发光[11]。尽管这些分析技术显示出临床潜力，但仍存在一些缺点。例如，ELISA程序繁琐且试剂成本较高，不适合现场检测。同时，利用光致发光的ZnO量子点标记免疫传感器的检测限低至0.25?U/mL，但这种传感器容易受到背景干扰且灵敏度有限[11]。与传统检测方法相比，电化学免疫传感器（ECI）因样品预处理简单、操作方便和成本低廉而受到广泛关注[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。例如，含有纳米结构碳纳米洋葱膜的电容式生物传感器实现了低至0.12?U/mL的检测限，并成功区分了临床血清样本[18]。同样，AuAg空心纳米晶体也被用于无标记ECI，通过增强氧还原电流实现了低至0.228?U/mL的检测[19]。此外，基于TiO?–Nafion的阳离子交换平台可以同时检测CA19-9和CA15-3，检测限分别为1.6?U/mL和0.3?U/mL[20]。虽然这些方法表现出优异的检测限，但在ECI中实现高灵敏度和稳定的电化学信号仍是一个挑战。在这种情况下，夹心型ECI显示出解决这些问题的巨大潜力[21]、[22]、[23]、[24]。因此，开发用于构建夹心型ECI的稳定高效材料至关重要。

众所周知，高性能的电极材料是电化学传感器的核心，电极材料应提供较大的比表面积和电催化活性中心，以为检测目标提供氧化还原位点[25]、[26]。金属有机框架（MOFs），特别是基于过渡金属（TMB）的MOFs，由于其较大的比表面积和丰富的金属活性位点，非常适合电化学传感[27]、[28]、[29]。因此，它们具有出色的吸附和富集能力，而相对稳定的金属-配体键满足了高性能电化学传感器的核心要求[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。例如，基于AuNPs/CuCo?S?的ECI实现了超灵敏的PSA检测，检测限为14?fg/mL，线性范围为50?fg/mL至500?ng/mL[35]。在过渡金属离子中，选择了d¹⁰构型的Cd²⁺离子作为金属中心。虽然封闭壳层的d¹⁰构型本身不具有氧化还原活性，但其充满的轨道壳层赋予了高极化率，有助于通过MOF框架高效传递电荷。这种独特的电子结构，加上Cd²⁺的多重配位位点，不仅赋予了MOF高电化学活性，还使其能够与多齿配体形成稳定的配位结构[37]、[38]。选择有机配体对于构建高灵敏度的新型Cd MOF ECI至关重要。其中，多苯羧酸配体在ECI中受到了广泛关注，这些配体的刚性共轭骨架和丰富的羧基位点可以与金属离子形成稳定的三维MOF网络。例如，孙迪等人报道了四种基于混合多齿N-供体和联苯羧酸配体的Cd配位聚合物，并研究了它们的合成、结构和光致发光特性[39]。梁等人报道了一系列基于V形四羧酸配体H?L的3D Co、Zn、Cd MOFs和Eu负载MOFs，并研究了它们的选择性吸附和发光传感特性[40]。尽管多苯羧酸在气体吸附和发光传感领域表现良好，但这些MOFs在CA19-9的电化学检测领域的研究较少。

尽管MOF-199具有优异的多孔结构、内在的电化学信号能力和稳定性，但其较差的导电性限制了其高灵敏度[41]。加入金纳米粒子等贵金属不仅可以提高导电性和电催化作用以放大信号，还可以提供额外的结合位点[42]、[43]、[44]。然而，使用这种掺金MOF-199复合材料进行电化学CA19-9检测的报道仍然很少[45]、[46]、[47]、[48]。到目前为止，关于在Cd-dpAc和MOF-199系统中掺入金纳米粒子用于ECI检测CA19-9的报道很少。

在本研究中，我们开发了一种高灵敏度的夹心型ECI用于检测CA19-9。2,6-二(3,5-二羧基苯基)-4-乙酰氨基苯甲酸（H₅dpac）是一种多苯羧酸配体，含有五个羧基和一个酰胺官能团。H₅dpac由于其丰富的羧基而具有强的配位能力和多位点结合潜力，而酰胺基团显著增强了氢键相互作用。中央苯环上的大空间位阻取代基限制了分子的旋转，使其具有更高的构象刚性，有利于形成清晰稳定的配位网络。因此，基于H₅dpac的Cd-MOF（Cd-dpac）的结构分析及其在ECI中的应用非常重要且具有前景。使用H₅dpac作为配体，Cd作为中心离子，通过水热法合成了Cd-dpac。通过化学还原，AuNPs均匀分布在Cd-dpac（AuNPs/Cd-dpac）上作为电极基底。采用改进的方法合成了AuNPs/MOF-199作为二次抗体探针。分析了Cd-dpac的晶体结构和形态。构建的夹心型ECI（AuNPs/MOF-199-Ab₂/CA19-9-Ag/BSA/CA19-9-Ab₁/AuNPs/Cd-dpac/GCE）通过循环伏安法（CV）监测修饰过程中的氧化还原峰变化。结合交流阻抗谱（EIS）分析界面电荷转移阻抗，系统验证了电极界面的逐层修饰效果。差分脉冲伏安法在优化条件下检测电化学信号，研究了CA19-9浓度与信号响应之间的关系。通过选择性实验、重复性测试和血清样本分析评估了传感器的灵敏度、稳定性和实际应用价值。

试剂和设备

本研究中使用的仪器和化学品的详细信息见补充文件S1和S2。

Cd-dpac的合成

Cd-dpac采用溶剂-热法合成。首先，将0.18?g（0.522?mM）的Cd（NO?）₂·6H?O和0.05?g（0.0986?mM）的H?dpac加入N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和水的混合溶液中（2:1?v/v）。搅拌三小时后，向混合物中加入适量的1?M HNO?。然后在90?°C下反应三天。冷却至室温后...

Cd-dpac的合成和晶体结构

Cd-dpac采用溶剂热法合成，以H₅dpac作为配体，硝酸镉作为前驱体，在DMF-H₂O（2:1?v/v）混合溶剂中，加入1?M HNO₃作为调节剂。通过优化配体与金属、反应溶剂和反应温度的比例，获得了高纯度和产量的单晶。晶体结构通过X射线单晶衍射分析确定。

单晶X射线衍射分析显示，Cd-dpac结晶属于空间群P2₁2121

结论

本研究报道了一种基于AuNPs/Cd-dpac和AuNPs/MOF-199复合材料的夹心型ECI，用于高灵敏度检测肿瘤标志物CA19-9。通过将金纳米粒子（AuNPs）固定在两种MOF材料上，制备出了具有高导电性、大活性表面积和优异电催化传感能力的电极材料。用这些先进材料制造的免疫传感器表现出出色的分析性能，具有宽线性范围...

CRediT作者贡献声明

张欣：撰写——原始草案，数据整理。蒲凤英：数据整理。徐永奇：正式分析。吴双燕：资金获取。孙亚光：概念构思。孙启宇：监督，资金获取。张颖：撰写——审稿与编辑，资金获取。林琳：资金获取。朱明昌：资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（22301190）、辽宁省科技项目管理（2023-MSLH-268、2023-MS-328）、辽宁省教育厅基础研究项目（JYTMS20231506、20231494）、沈阳化工大学科技重点项目（2023DB003）、沈阳化工大学“优秀青年”支持计划（2022YQ010）以及辽宁省科技计划项目（2023JH1/10400039）的财政支持。