《Poultry Science》：Age differences in fear response of laying hens exposed to isolation test in light and dark environments
编辑推荐：
本研究针对家禽福利评估中广泛使用的隔离恐惧测试，深入探讨了不同周龄（12日龄、12周龄、26周龄、70周龄）W-36蛋鸡在光照与黑暗环境中隔离90分钟后的行为与生理响应。研究人员通过分析鸣叫行为、血清皮质酮水平以及大脑多个区域（如中脑、间脑、端脑）的多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）神经递质周转率，揭示了年龄和环境光照对恐惧反应的显著影响。结果表明，恐惧反应的评估指标（鸣叫行为、神经递质、皮质酮）存在年龄特异性差异，提示单一指标不足以全面评估家禽福利，需结合多维度指标。此研究为理解家禽恐惧反应的神经内分泌机制及制定更精准的福利评估方案提供了重要依据。
在动物福利研究领域，准确评估家禽的情感状态至关重要。隔离恐惧测试是一种常用的行为学测试方法，通常通过观察禽类在短暂隔离后的鸣叫行为（如首次鸣叫延迟和鸣叫频率）来推断其恐惧程度。然而，这种测试方法背后的神经内分泌机制却鲜为人知。此外，有证据表明，禽类对压力的生理和行为反应可能随着年龄的增长而发生变化，例如下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的反应性以及大脑内关键神经递质如多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）的活性都可能存在年龄依赖性差异。这引出了一个关键问题：在不同生命周期阶段，相同的恐惧刺激是否会引发相同的神经生物学和行为响应？为了回答这个问题，研究人员以蛋鸡为模型，深入探究了年龄和环境光照条件如何共同影响其隔离恐惧反应。
为了阐明年龄和环境光照对蛋鸡隔离恐惧反应的影响，研究人员设计了一项严谨的实验。他们选取了四个关键年龄点的W-36品系蛋鸡：12日龄（雏鸡）、12周龄（小母鸡）、26周龄（产蛋高峰期母鸡）和70周龄（老年母鸡）。每个年龄点设置三个处理组：对照组（CON，直接从饲养笼取出并处死）、光照隔离组（LIGHT，在消声室中光照下隔离90分钟）和黑暗隔离组（DARK，在消声室中黑暗环境下隔离90分钟），每组12只鸡。研究采用的关键技术方法包括：1）行为学分析：使用专业音频设备记录隔离期间的鸣叫，并分析首次鸣叫延迟、鸣叫频率和总鸣叫次数；2）神经化学分析：通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）技术测定大脑特定区域（包括尾侧中脑CM、吻侧中脑RM、间脑DI、外侧端脑LT和内侧端脑MT）的DA、5-HT及其代谢产物的浓度，并计算周转率（Turnover）作为神经递质活性的指标；3）激素测定：采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中的皮质酮浓度，以评估HPA轴的激活状态；4）褪黑素水平检测：同样使用质谱法测量大脑各区域的褪黑素含量，以评估光照处理的有效性及年龄相关变化。所有数据均使用SAS软件进行统计学分析，包括方差分析（ANOVA）和混合线性模型，以评估年龄、处理及其交互作用的影响。
研究结果
雏鸡（12日龄）
行为方面，在90分钟的隔离期内，黑暗环境中的雏鸡比光照环境下的雏鸡鸣叫总数更多、频率更高。神经化学方面，黑暗组和光照组雏鸡在内侧端脑（MT）的5-HT周转率均显示出高于对照组的趋势，提示隔离可能引发了负面情感状态。此外，黑暗环境下所有脑区的褪黑素水平均显著高于光照组和对照组，表明光照处理有效。然而，血清皮质酮水平在各处理组间无显著差异，提示HPA轴在此年龄阶段可能尚未成熟或对隔离应激不敏感。
小母鸡（12周龄）
此年龄组的结果最为稳定。无论是在3分钟还是90分钟的观察期内，光照组和黑暗组在鸣叫行为（延迟、频率、总数）上均无显著差异。大脑神经递质周转率（DA和5-HT）除内侧端脑（MT）的DA周转率在隔离组（光照和黑暗）高于对照组外，其他脑区均无显著变化。皮质酮水平同样无组间差异。黑暗环境仍能有效诱导褪黑素水平升高。
产蛋高峰期母鸡（26周龄）
行为上，光照环境下的母鸡表现出更强的恐惧反应：其在3分钟和90分钟内的首次鸣叫延迟更短，鸣叫频率和总数均显著高于黑暗组。神经化学上，光照组母鸡在尾侧中脑（CM）、吻侧中脑（RM）和外侧端脑（LT）的5-HT周转率显著高于黑暗组和对照组；在外侧端脑（LT）的DA周转率也高于黑暗组和对照组。生理上，无论是光照还是黑暗隔离，母鸡的血清皮质酮水平均显著高于对照组，表明HPA轴被激活。然而，脑区褪黑素水平在各组间无差异，提示其光响应机制可能发生变化。
老年母鸡（70周龄）
行为上，光照组母鸡的鸣叫频率和总数在3分钟和90分钟时均高于黑暗组，且首次鸣叫延迟更短。神经化学上，黑暗组母鸡在外侧端脑（LT）和内侧端脑（MT）的5-HT周转率显著高于对照组。DA周转率和皮质酮水平在各组间无显著差异。与产蛋高峰期母鸡类似，褪黑素水平也未显示出处理组间的差异。
跨年龄分析
综合分析揭示了明显的年龄效应。皮质酮水平随年龄变化显著，小母鸡和老年母鸡的水平高于雏鸡和产蛋高峰期母鸡。鸣叫行为（如90分钟内的鸣叫总数和频率）在产蛋高峰期母鸡中最为活跃，且光照组普遍高于黑暗组。神经递质周转率在不同脑区和年龄点呈现复杂但规律性的变化模式，例如，老年母鸡在多个脑区的5-HT周转率高于其他年龄组，而产蛋高峰期母鸡的DA和5-HT周转率在某些脑区则相对较低。
研究结论与意义
本研究通过多维度指标（行为、神经内分泌、神经化学）系统地评估了蛋鸡在不同年龄阶段对隔离恐惧的反应，并揭示了光照环境的调节作用。主要结论包括：首先，恐惧反应的表达具有显著的年龄特异性。雏鸡对黑暗隔离更敏感，而产蛋高峰期和老年母鸡则对光照隔离反应更强烈，小母鸡阶段则相对不敏感。其次，评估恐惧的生物学指标并非总是一致。例如，只有产蛋高峰期母鸡表现出显著的皮质酮反应，但所有年龄组（除小母鸡外）都通过鸣叫行为或神经递质周转率的变化显示出恐惧或应激状态。这表明依赖单一指标（如传统的3分钟鸣叫测试或皮质酮水平）来评估家禽福利可能存在局限性，需要结合年龄因素进行综合判断。此外，老年母鸡褪黑素对黑暗反应减弱，以及产蛋高峰期母鸡神经递质活动与行为反应的关联，提示性腺激素状态可能深刻影响恐惧反应的神经生物学基础。
这项研究的意义在于，它强调了在家禽福利研究和实践中考虑年龄因素的重要性。研究结果挑战了传统隔离恐惧测试的普适性解读，呼吁开发更精细、更年龄特异性的福利评估工具。论文发表在《Poultry Science》上，为家禽行为学、神经内分泌学及动物福利科学提供了宝贵的实证数据，对改进饲养管理实践、提升家禽终身福利具有重要的指导价值。未来的研究可以进一步探索其背后的分子机制，以及不同品系家禽是否存在类似的反应模式。
