《Sensors and Actuators Reports》：Challenges and strategies for CRISPR-Cas molecular diagnostics from mechanism to Clinical Translation
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这篇综述系统性探讨了CRISPR-Cas系统在分子诊断领域的突破性潜力，重点剖析了其如何克服传统方法（如PCR）在便携性、多重检测和即时检测（POCT）应用方面的局限性。文章从Cas酶（Cas9、Cas12、Cas13、Cas14）的顺式/反式切割机制分类入手，深入阐述了通过Cas蛋白工程化（如高保真变体）、crRNA人工智能设计、样本预处理（如磁珠富集）、反应体系优化（结合等温扩增和数字分区）以及信号增强策略（荧光、电化学、侧向流、智能手机检测）等多维度手段提升检测性能。综述评估了其在传染病（如SARS-CoV-2、HPV）、精准肿瘤学（液体活检）、遗传病（SNP、非整倍体）及慢性/免疫疾病（细胞因子等生物标志物）诊断中的广泛应用，同时批判性分析了其在提升效率、标准化、可重复性、成本控制及伦理考量方面面临的挑战，为CRISPR-Cas分子诊断的临床转化和商业化奠定了坚实基础。
CRISPR-Cas分子诊断系统的核心机制与分类
分子诊断在疾病早期筛查、病原体检测和个性化医疗中扮演着关键角色。传统金标准聚合酶链式反应（PCR）虽灵敏度高，但依赖精密仪器和实验室环境，限制了其在资源有限地区的应用。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统（CRISPR-Cas）的出现，为分子诊断带来了革命性变革。CRISPR-Cas系统源于细菌和古菌的适应性免疫机制，利用向导RNA（gRNA）引导的靶核酸识别和Cas蛋白的反式切割活性进行信号放大，具备高灵敏度、高特异性、快速、设备要求低及多样化读值格式等优势。
关键Cas酶的分类与特性
多种CRISPR-Cas蛋白已被开发为生物医学工具，其中Cas9、Cas12、Cas13和Cas14是分子诊断平台开发的重点。
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Cas9分子检测与反式切割偏好：Cas9通过crRNA引导机制识别双链DNA（dsDNA），需要原间隔序列邻近基序（PAM，通常为NGG）。其主要具有顺式切割活性，但也存在反式切割能力，偏好切割富含胸腺嘧啶（T）/胞嘧啶（C）的单链DNA（ssDNA），而对dsDNA活性极低。其反式切割活性需要crRNA和tracrRNA双重引导，并在靶DNA结合后激活。当前CRISPR-Cas9分子诊断研究主要集中于利用野生型Cas9的顺式切割活性或催化失活dCas9的靶标结合能力，其在靶向DNA富集方面优势显著。
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Cas12分子检测与反式切割特性：Cas12能识别富含胸腺嘧啶的PAM，是病原体DNA检测的理想工具。Cas12b、Cas12f、Cas12j等亚型具有不同的PAM兼容性和增强的热稳定性。Cas12在激活后表现出非特异性ssDNA反式切割活性，这种活性可用于降解荧光-淬灭基团标记的探针进行信号放大。Cas12的反式切割活性对底物序列有偏好，例如对polyC序列的切割效率最高。通过缓冲液成分优化、报告探针长度调整（如15 nt为佳）以及蛋白质工程（如引入丙氨酸取代）可显著提升其检测性能。
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Cas13分子检测与反式切割：Cas13家族是唯一专门靶向RNA的CRISPR-Cas系统。其激活严格依赖crRNA与靶RNA的互补性，并具有双链核糖核酸酶活性。不同Cas13亚型在反式切割时表现出严格的序列偏好，例如LwaCas13a偏好切割含尿嘧啶（U）的基序，而LbaCas13a主要识别AC二核苷酸序列。Cas13d则具有更宽的间隔序列兼容性。
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Cas14分子检测与反式切割：Cas14是一种独特的CRISPR相关蛋白，具有dsDNA/ssDNA特异性识别和反式切割活性。它能在crRNA引导下特异性结合靶标dsDNA或ssDNA，并激活其反式切割活性，无差别降解附近的ssDNA。Cas14对较长的ssDNA探针表现出增强的切割效率，其级联放大效应可实现单分子灵敏度的检测。
CRISPR-Cas分子检测系统的性能优化策略
Cas蛋白工程化修饰
对Cas蛋白进行工程化改造是提升系统性能的核心策略之一。通过基于结构的理性设计或定向进化，可开发出高保真Cas变体（如HiFi-Cas12a）、扩展PAM兼容性的变体（如xCas9）、热稳定性增强的变体（如适应65°C的Alicyclobacillus Cas12b）以及可用于多重检测的正交系统（如Cas12a与Cas13a联用）。
crRNA工程化
crRNA的设计优化至关重要。深度学习平台可用于高效、合理的crRNA设计。此外，还包括错配敏感设计以优化种子序列、crRNA重构与功能化、拆分crRNA策略、化学修饰以及环化crRNA等策略，旨在提高特异性、效率和稳定性。
样本预处理与靶标富集
有效的样本富集和纯化对于提高检测灵敏度至关重要。策略包括磁珠法核酸提取、微流控样本浓缩、基于二氧化硅膜或纸基的核酸捕获、等电聚焦技术以及直接裂解法等，以满足不同应用场景的需求。
反应体系优化
优化反应体系组件及其协调相互作用是关键。这包括缓冲液配方优化、一锅法检测体系开发、实验设计方法学应用、RNase H的引入以增强逆转录效率，以及通过冻干技术、物理分隔实现反应组分的时空分离，从而简化工作流程，减少污染。
预扩增技术提升靶标浓度
将CRISPR-Cas系统与预扩增技术结合可显著提高灵敏度。等温扩增方法应用广泛。数字微流控平台可实现单分子分析。无酶扩增策略具有更好的稳定性。组合扩增方法可实现超低检测限。
读出信号增强策略
多样化的信号输出策略满足了不同场景的需求。光学信号转导策略应用普遍。电化学检测系统具有高灵敏度。机械信号放大策略和便携式检测系统为现场检测提供了可能。
数字分区与单分子检测
数字分区和单分子检测策略显著提高了CRISPR-Cas分子诊断的灵敏度和精密度。液滴数字PCR与CRISPR结合可实现绝对定量。
CRISPR-Cas分子诊断的多样化应用前景
传染病诊断
CRISPR-Cas平台已广泛应用于病毒、细菌、寄生虫和真菌的检测。例如SHERLOCK和DETECTR平台已成功用于SARS-CoV-2、HPV、登革热病毒等病原体的检测，部分已获得监管批准。
肿瘤精准医疗
在液体活检中，CRISPR-Cas系统可用于检测循环肿瘤DNA中的突变，用于癌症的早期发现和监测。此外，还可用于免疫治疗疗效预测。
遗传病筛查与产前诊断
CRISPR-Cas技术可用于单基因遗传病、染色体非整倍体以及线粒体疾病的快速分子诊断和产前筛查，具有高特异性和灵敏度。
慢性与免疫疾病管理
该技术可用于检测糖尿病并发症相关生物标志物以及自身免疫疾病相关的细胞因子等，为疾病管理提供重要信息。
CRISPR-Cas分子检测技术与临床应用面临的挑战与困境
尽管前景广阔，但其临床转化仍面临多重挑战。
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技术性能挑战：包括平衡灵敏度与特异性、脱靶效应、温度与反应条件兼容性等。
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临床应用挑战：复杂样本基质干扰、靶标异质性、操作便捷性与速度、临床验证与标准化不足是主要障碍。
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监管与产业化挑战：监管审批路径不明确、成本与可及性、工业化生产瓶颈等问题亟待解决。
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伦理与社会接受度挑战：公众对技术的误解、数据隐私、产前诊断的伦理争议以及生物安全风险都需要妥善应对。
结论与未来展望
CRISPR-Cas分子诊断技术展现出变革精准医学的巨大潜力，但其临床广泛应用仍需克服灵敏度与速度的权衡、基质干扰、标准化缺口和监管延迟等多方面障碍。未来发展方向包括通过蛋白质工程开发高性能Cas变体、整合微流控和人工智能实现自动化、开发智能稳定化系统以适应极端环境、加速多中心验证和标准化、降低成本以及确保合乎伦理的负责任发展。通过多学科合作，CRISPR-Cas系统有望成为精准医疗、环境监测和疫情防控的基石技术。
