一种可通过酶锚定和电荷驱动双重靶向技术在活细胞中激活hMAO-B的线粒体结合荧光探针

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：An hMAO-B-activatable mitochondrial binding fluorescent probe in live-cell via enzyme-anchored and charge-driven dual targeting

hMAO-B荧光探针THT-MTP基于硫色素结构，通过酶催化氧化MTP为MPy+实现荧光增强>100倍，验证其特异性及高灵敏度，并展示高效线粒体富集能力，为神经退行性疾病和肝疾病诊断提供新工具。

　　

李思琪|马琳|林蓉|李雄旺|姚新毅|胡玉飞|郎佳佳|袁中华|米鹏兵

中南大学衡阳医学院药学院，中国湖南省衡阳市421001

摘要

酶响应性（ER）探针针对人类单胺氧化酶B（hMAO-B）是研究多种疾病的关键工具，包括神经退行性疾病、肝脏疾病、心力衰竭、代谢紊乱和癌症。本文报道了THT-MTP——一种基于硫铬酮的荧光探针，其对hMAO-B具有高度敏感性和特异性，该探针在hMAO-B的催化下其MTP部分氧化转化为MPy⁺，同时荧光强度增强超过100倍。通过safinamide抑制实验在酶模型和细胞模型中验证了其激活机制。hMAO-B激活的成像能力表明，其荧光强度与细胞系中的酶水平成正比，不同细胞系中hMAO-B的表达量依次为HepG2 > SH-SY5Y > NIH-3T3。THT-MTP通过酶锚定和电荷驱动的双重靶向机制在细胞内有效积累。这项工作为设计hMAO-B选择性探针提供了范例，这些探针结合了高精度的亚细胞靶向、可激活的成像能力和无需洗涤的操作特点，为研究hMAO-B相关疾病提供了强大的分子工具。

引言

人类单胺氧化酶（hMAOs）是重要的线粒体膜结合黄素酶，参与神经递质代谢和氧化平衡[1]、[2]。它们催化单胺衍生物的氧化，生成H₂O₂（过氧化氢）和亚胺离子，后者进一步自发降解为醛类，以及氨（来自一级胺）或取代胺（来自二级胺）[3]、[4]（图1A）。多项研究表明，两种密切相关的同工酶：人类单胺氧化酶A（hMAO-A）和人类单胺氧化酶B（hMAO-B）在底物特异性和组织分布上存在差异[5]、[6]。hMAO-B主要代谢苯乙胺，其异常活性与肝脏疾病（肝纤维化和肝癌）和神经退行性疾病（帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）有关[7]、[8]。相比之下，hMAO-A更偏好血清素和去甲肾上腺素，其失调与抑郁症和精神分裂症等精神障碍有关。例如，在帕金森病患者的脑部和外周血淋巴细胞中观察到hMAO-B的异常活性，而在前列腺癌、胶质瘤和其他肿瘤组织中则发现hMAO-A过度表达[8]、[9]、[10]。

特异性检测hMAO-B而非hMAO-A对于阐明疾病机制、实现早期诊断和监测治疗效果至关重要，因为hMAO-B是肝脏疾病和神经退行性疾病的重要的生物标志物[11]、[12]、[13]。利用高特异性酶催化进行激活的酶响应性（ER）荧光探针是检测hMAO活性的理想工具，在灵敏度、时空分辨率和原位分析方面具有显著优势，适用于hMAO活性的实时成像和疾病诊断[14]、[15]、[16]。然而，ER荧光探针的开发主要集中在选择性检测hMAO-A或两种异构体之一[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。针对hMAO-B的特异性检测，仅有少数探针使用胺类作为离去基团（图1B）。2012年，朱等人报道了通过hMAO-B催化的N-甲基四氢吡啶部分氧化去除香豆素骨架上的荧光探针P1[25]、[26]。随后，姚等人使用3-氨基丙基氨基甲酸酯衍生物作为识别基团开发了用于帕金森病的U1探针[8]、[27]、[28]。2019年，余等人设计了DEAN-MA探针，该探针通过hMAO-B介导的氧化反应后发生分子内环化[29]。此外，唐等人还利用级联酰亚胺化反应设计了BiphAA探针，用于早期诊断肝纤维化[30]。

关键的是，现有探针很少使用取代胺作为识别基团。取代胺如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MTPP）在hMAO-B的作用下转化为MPP⁺，同时形成优化的D–π–A结构并带有正电荷[31]。这些特性协同增强了信号强度和线粒体结合能力。基于这一策略，我们用N-甲基四氢吡啶（MTP）替换了之前hMAO-B抑制剂设计中的芳基团，开发出hMAO-B选择性ER荧光探针[32]。如图1C所示，MTP在hMAO-B的作用下氧化生成MPy⁺，形成优化的D–π–A结构。这种策略增强了电子供体效应，显著缩小了HOMO-LUMO能隙并促进了分子内电荷转移（ICT），从而产生荧光信号。我们进一步研究了其光化学和光物理性质，并使用重组蛋白以及SH-SY5Y和NIH-3T3细胞系评估了其对hMAO的特异性。这种方法为快速、高选择性地监测hMAO活性提供了直接途径，并在hMAO-B相关疾病的早期诊断中具有巨大潜力。

具体hMAO-B探针的设计原理

hMAO-B引起的特异性荧光“开启”是设计hMAO-B选择性荧光探针的最重要特征。基于我们之前的研究，硫铬酮骨架在开发具有天然荧光特性的高选择性hMAO-B抑制剂方面显示出巨大潜力[32]、[33]、[34]、[35]。我们假设通过将hMAO反应基团与硫铬酮连接起来来开发特定的hMAO-B探针。因此，如图1所示，分子设计...

结论

总之，我们开发了一种高选择性的hMAO-B激活荧光探针THT-MTP，基于潜在的D-π-A结构。在hMAO-B的激活下，该探针的荧光强度增强了100倍以上。其激活机制通过safinamide抑制实验在酶模型和细胞模型中得到了严格验证。重要的是，该探针在hMAO-B的作用下能够在线粒体上有效积累，并带有正电荷。这项工作为hMAO-B选择性探针的设计提供了范例。

一般信息

所有试剂均从商业渠道购买（Adamas-beta?、Energy Chemical和江苏Aikon等），除非另有说明，否则无需进行处理。化合物THT-Br的制备方法如文献[32]、[33]中所述。所有反应均在金属砂浴（WATTCAS，LAB-500，https://www.wattcas.com）中加热进行。对水分或氧气敏感的反应在氮气氛围下进行。产物通过硅胶柱层析纯化。

作者贡献

米鹏、袁中华和郎佳佳构思了本文。李珊和马琳负责生物实验，林蓉提供了所有细胞，李晓、姚新毅和胡玉飞协助了合成实验，李珊和米鹏兵撰写了初稿，袁中华、袁中华和郎佳佳审阅、评论并编辑了手稿。所有作者都对最终版本的手稿给予了认可。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

感谢国家重点研发计划（2020YFA0714002）和中南大学（190XQD142）的资助。