《Nature Communications》：In situ visualization of Clostridioides difficile phenotypic heterogeneity and single-cell morphology during gut infection
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本研究针对细菌表型异质性在复杂肠道环境中难以原位可视化的问题，开发了光谱兼容的双荧光报告系统，实现了对艰难梭菌（Clostridioides difficile）毒素基因表达异质性的单细胞水平原位观测。研究发现毒素表达与细菌空间分布无直接关联，并首次发现高毒素表达突变体（ΔrstA）在急性感染期形成丝状细胞形态。该技术为研究肠道微生物的空间行为提供了通用平台，相关成果发表于《Nature Communications》。
在人体肠道这个微生物密度极高的复杂生态系统中，细菌如何通过表型异质性适应环境一直是个谜。尤其对于医院内常见病原体艰难梭菌（Clostridioides difficile）而言，其毒素基因表达呈现双峰分布，但这种异质性在真实感染过程中的空间分布规律及其生物学意义始终未被揭示。传统技术如荧光原位杂交（FISH）虽能定位细菌，却无法区分同一菌种内不同表型的亚群。更关键的是，结肠内极高的微生物密度和动态变化使得单细胞水平原位观测面临巨大技术挑战。
为突破这一瓶颈，塔夫茨大学研究团队在《Nature Communications》发表的研究中，构建了染色体整合的光谱兼容荧光报告系统。通过优化mNeonGreen（mNG）和mScarlet-I3（mScI3）荧光蛋白的表达强度，获得了与野生型菌株适应性相当的组成型报告菌株（Pcwp2::LP-mScI3* 和 PslpA::mNG）。进而开发的双报告系统（Pcwp2::LP-mScI3*/PtcdA::mNG）首次实现了感染过程中毒素基因表达的原位动态追踪。
关键技术方法包括：利用等位基因交换（ACE）构建染色体整合报告菌株；通过竞争性感染实验评估菌株适应性；结合冷冻切片与多通道荧光显微成像，建立单细胞水平定量分析方法；采用毒素基因表达信号标准化处理（PtcdA::mNG/Pcwp2::LP-mScI3*）消除技术误差。
报告菌株的体内外验证
组成型报告菌株在体外培养中保持均匀荧光且生长不受影响。小鼠感染实验表明，Pcwp2::LP-mScI3* 和 PslpA::mNG 报告菌株能稳定定植并引起典型疾病表现。空间分布分析首次发现艰难梭菌存在上皮关联亚群，突破其仅为腔道病原体的传统认知。
毒素表达异质性的时空特征
双报告菌株（WT）感染显示20%细胞为"毒素开启"（Toxin-ON）状态，而负调控因子RstA缺失株（ΔrstA）的毒素表达频率升高至57%。值得注意的是，毒素表达强度与频率在不同肠道区域（腔道、黏膜、上皮）无显著差异，且毒素缺失株（ΔtcdR*）仍能定植于上皮附近，表明毒素产生并非空间定位的决定因素。
突变体特异性形态异常
急性感染期（第2天），ΔrstA* 菌株出现显著细胞形态异常：平均长度增加1.5倍，19%细胞呈现弯曲丝状（野生型仅3%）。这种表型具有时相特异性，在体外培养或感染后期（第14天）均未出现。进一步实验表明，该形态异常与高毒素表达相关，但并非单纯由荧光蛋白过表达引起，提示RstA缺失可能影响细胞分裂调控。
技术平台的通用性价值
本研究建立的双荧光报告系统突破了过去对肠道微生物"黑箱式"研究的局限，首次实现复杂环境中细菌表型异质性的原位解析。发现的上皮关联亚群为理解毒素递送和感染复发提供了新视角，而ΔrstA突变体的感染期特异性形态变化则揭示了体内外环境的本质差异。该技术框架可扩展至其他梭菌属研究，为微生物空间行为学提供通用工具。
研究结论强调，艰难梭菌通过毒素表达异质性实施"风险对冲"策略：毒素产生细胞负责破坏上皮释放营养，非产生细胞则可能专注于孢子形成等传播相关功能。这种分工协作策略在RstA调控缺失时被打破，导致种群适应性下降。该工作不仅深化了对病原体-宿主互作的理解，更建立了研究肠道微生物生态的新范式。
