《Nature Communications》：Dynamic allele usage of X-linked genes ameliorates neurodevelopmental disease phenotypes in brain organoids
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本研究针对X连锁基因在女性神经发育中的动态表达调控机制，通过脑类器官模型揭示X染色体失活逃逸现象如何缓解Opitz BBB/G综合征等神经发育障碍的表型，为理解疾病性别差异提供了新视角。
在胎盘类雌性哺乳动物的体细胞中，一条X染色体会随机失活，形成沉默的基因库。然而，有相当一部分X染色体上的基因能够逃逸这种失活过程。除了在所有细胞和组织中均逃逸失活的“完全逃逸者”外，还有数量相近的基因属于“条件性逃逸”，其双等位基因表达仅见于特定组织，且个体间存在异质性。逃逸X染色体失活会导致双等位基因表达，并常常引起女性表达偏倚，即女性组织中相同基因的表达水平高于男性。神经发育障碍（NDDs）表现出有趣的性别偏倚，女性患者较少见且症状通常较男性轻。尽管NDD相关基因均匀分布于所有常染色体，但它们在X染色体上存在过度代表性，凸显了X染色体在NDD表型形成中的重要作用。
然而，用于研究人类不完全X染色体失活动态的模型系统目前主要局限于尸检组织，这忽视了发育轨迹。此外，男性X连锁基因的半合子状态以及女性的随机X染色体失活仅能部分解释为何女性受NDD影响更小、更轻。研究人员假设，动态的X染色体再激活为女性神经组织提供了一种保护机制，降低了NDD的发生频率和严重程度。
为了验证这一假说，研究人员利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官模型，研究了Opitz BBB/G综合征（OS）这种X连锁神经发育障碍。OS由X连锁的MID1基因突变引起。研究发现，MID1在神经分化过程中会发生动态再激活。虽然源自男性OS患者iPSC的脑类器官表现出分化神经元急剧减少，并伴有神经干祖细胞（NPCs）细胞周期退出延迟，但携带相同突变（位于其活性X染色体上）的女性细胞来源的类器官则表现出明显更温和的、中间类型的表型。为了探究失活X染色体上等位基因的影响，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将相同的患者特异性功能缺失突变同时引入活性X和失活X染色体。引人注目的是，源自这些纯合OS女性iPSC系的脑类器官表现出与半合子男性类器官相似的表型。这证明失活X染色体上的等位基因显著影响表型发展。
通过追踪神经分化轨迹中的等位基因特异性表达，研究人员发现了一系列基因在分化诱导下，会从失活X染色体上发生动态再激活或延迟沉默，导致位点和谱系特异性的双等位基因使用。在模拟OS的脑类器官中，来自失活X染色体的等位基因的再激活挽救了细胞表型，并导致女性组织中出现中间类型的表现。单细胞RNA测序（scRNA-seq）和RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）等技术在细胞水平证实了这种再激活现象。此外，研究还发现再激活的基因在X染色体上成簇分布，并且与女性胎儿脑组织中的活跃染色质状态（如H3K36me3富集）相关，而与抑制性染色质标记（如H3K9me3）关联较少。研究进一步在小鼠胚胎中证实了Mid1同源基因也存在类似的动态、细胞和组织特异性等位基因使用，表明这种分化特异性条件性逃逸是哺乳动物的一个普遍特征，而非人类特有。
对发育中人类脊髓囊的单细胞RNA测序数据的再分析表明，双等位基因表达在祖细胞阶段最高，并随着分化而减弱。重要的是，研究发现再激活的基因显著富集于神经发育障碍相关基因。蛋白互作网络分析显示，这些再激活的基因参与RNA结合、组蛋白结合等表观遗传调控过程以及蛋白质泛素化。MID1是该网络中的枢纽蛋白之一。机制上，研究发现MID1缺失会导致其靶蛋白PAX6水平升高，进而可能影响细胞周期调节蛋白p21，改变NPCs的增殖/分化平衡。
综上所述，这项研究揭示了一种此前未被发现的雌性脑细胞中分化依赖的基因调控机制，该机制通过动态增加可用等位基因库的多样性，增强了女性神经组织对X连锁神经发育障碍的韧性。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：利用患者来源的成纤维细胞重编程建立诱导多能干细胞（iPSC）系，并结合CRISPR/Cas9基因编辑构建特定基因型的细胞模型；通过二维神经诱导分化获得神经干祖细胞（NPCs）和神经元，以及三维脑类器官培养系统模拟早期人脑发育；采用等位基因特异性表达分析（如QUASEP、RNA-seq、scRNA/snRNA-seq）、RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）在群体和单细胞水平追踪X染色体等位基因使用动态；利用生物信息学方法分析染色质状态、组蛋白修饰、基因共表达网络和蛋白互作关系；并通过免疫荧光染色、Western blot等技术进行蛋白水平验证。样本队列包括来自国外研究中心（如德国美因茨大学医学中心、布里斯托遗传学实验室等）的患者和健康个体来源的细胞。
Reactivating genes cluster and are associated with active chromatin
再激活的基因在X染色体上并非随机分布，而是显著成簇出现。与持续失活的基因相比，再激活基因和完全逃逸基因在女性胎儿脑组织中显著富集于活跃的转录相关染色质状态（如“活跃转录起始位点侧翼”、“强转录”和“弱转录”），并伴有活跃标记H3K36me3在基因体内的信号增强以及异染色质标记H3K9me3信号的减弱。而延迟沉默基因则与抑制性染色质状态和双价/预备状态的启动子标记（如H3K27me3和H3K4me1）相关。这表明条件性逃逸是通过动态变化的染色质状态实现的，允许X连锁基因进行位点、谱系和发育时间依赖性的再激活和延迟沉默。
Dynamic escape is conserved in the mouse
研究发现在小鼠中也存在神经分化过程中NPC特异性的条件性逃逸基因。人类神经分化过程中再激活的基因中有50%在小鼠中也存在条件性或NPC特异性的逃逸。特别是小鼠Mid1基因，虽然在脑和皮肤组织中均存在单等位和双等位表达，但大脑中双等位表达的细胞比例显著高于皮肤，表明其在小鼠胚胎中也是一种具有动态细胞和组织特异性等位基因使用的条件性逃逸基因，这与人类模型中的分化诱导再激活相似，提示物种间存在保守的调控元件。
Dynamic allele usage of X-linked genes in human developing tissue
对脑类器官和人类胚胎发育中脊髓囊的单细胞核RNA测序分析显示，X连锁基因的双等位基因表达在iPSCs中较低，但在向NPCs和特定神经元谱系分化过程中显著增加。这种双等位基因表达的程度在不同细胞簇和分化轨迹间高度可变，且在分化轨迹起始端（iPSCs）总体较低。重要的是，在XIST高表达和低表达的细胞中均观察到相当水平的再激活，表明再激活和延迟沉默更依赖于发育时间点而非XIST表达水平。在体内发育的脊髓囊数据中，双等位基因表达在祖细胞阶段最高，并随着分化而减弱，且在发育较晚的胚胎（CS19）中双等位表达程度总体较低。
X-reactivation impacts on phenotype dimorphism of OS
研究发现再激活的基因（而非完全逃逸或延迟沉默基因）显著富集于神经发育障碍相关基因。利用OS脑类器官模型，研究发现与野生型对照相比，MID1突变类器官（包括男性半合子M-OS/male和女性纯合子J-OS/hom, A-OS/hom）中MAP2+神经元比例减少，NPCs标志物SOX2+区域（VZLS）面积增加，重现了OS患者的小脑蚓部发育不全和小头畸形。而女性杂合子类器官（M-OS/het, J-OS/het, A-OS/het）则表现出介于野生型和纯合/半合突变型之间的中间表型。等位特异性RT-PCR和Western blot证实，在杂合子NPCs中，失活X染色体上的野生型MID1等位基因发生再激活，表达了野生型MID1蛋白。CRISPR/Cas9介导的男性细胞突变修复（M-OS/maleR）可挽救表型，证实了表型对MID1的依赖性。BrdU脉冲追踪实验表明MID1调控NPCs的增殖与分化平衡。
The MID1 target PAX6 correlates with OS phenotype attenuation
在分子机制上，研究发现MID1缺失导致其底物蛋白PAX6在类器官VZLS区域的蛋白水平显著升高，在纯合/半合突变中升高最为显著，杂合子中程度较轻。PAX6水平升高伴随其靶点p21蛋白水平上调，导致更多的非顶端有丝分裂NPCs积累。这提示PAX6-p21通路可能介导了MID1突变引起的表型。女性杂合子中由于失活X染色体上野生型等位基因的再激活，部分挽救了表型，从分子水平上证实了这种保护机制。
本研究首次系统揭示了X连锁基因在人类神经分化过程中的动态等位基因使用是女性神经组织韧性的重要机制。不仅发现了大量在神经分化过程中从失活X染色体再激活或延迟沉默的基因，证明了它们与神经发育障碍的显著关联，更重要的是利用精确基因编辑的疾病模型，直接证实了失活X染色体上野生型等位基因的再激活能够缓解疾病表型。这为理解神经发育障碍的性别差异提供了全新的分子机制解释，揭示了女性大脑天然具备的、通过动态调控X染色体剂量来缓冲基因突变影响的“安全网”。该发现对认识X连锁疾病的发病机制、临床表现的性别差异以及开发新的治疗策略具有重要意义。
