《Nature Communications》：A scalable two-step genome editing strategy for generating full-length gene-humanized mice at diverse genomic loci
编辑推荐：
本研究针对传统基因人源化技术难以实现大片段基因组替换的瓶颈，开发了名为TECHNO的双步CRISPR/Cas9同源重组技术。该策略通过胚胎干细胞连续编辑成功将超过200 kbp的人类基因组片段精准插入小鼠基因座，在c-Kit、APOBEC3簇和CYBB等模型中重现人类基因的组织特异性表达和剪切模式，并成功构建慢性肉芽肿病（CGD）疾病模型。该方法为人类基因功能研究和疾病机制解析提供了高效平台。
在生物医学研究中，小鼠因其与人类基因高度同源而成为不可或缺的模型生物。然而，物种间非编码区和调控元件的差异常导致基因表达模式不同，限制了小鼠模型在模拟人类生物学过程中的应用。全长度基因人源化（FL-GH）通过完整替换小鼠基因座为人类同源序列，有望解决这一难题，但传统技术受限于DNA插入片段大小、复杂操作流程和特殊材料需求，难以实现超过10 kbp的大片段精准替换。
针对这一挑战，日本东京大学医学科学研究所的田口淳平（Jumpei Taguchi）团队在《Nature Communications》发表研究，提出名为TECHNO（Two-step ES Cell-based HumaNizatiOn）的双步基因组编辑策略。该技术通过胚胎干细胞（ES细胞）中连续两次CRISPR/Cas9介导的同源重组，成功实现长达205 kbp人类基因组片段的精准敲入，并证明人源化基因可重现人类组织特异性表达和功能。
关键技术方法
研究采用双步编辑策略：第一步通过CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）靶向切除目标基因座，并插入含人类基因同源臂的耐药表达框；第二步利用细菌人工染色体（BAC）携带完整人类基因组片段，通过同源重组实现大片段敲入。实验使用C57BL/6、BALB/c等多品系小鼠ES细胞，通过流式细胞术、RNA测序（RNA-seq）、荧光原位杂交（FISH）和免疫印迹等技术验证敲入效率与基因功能。
研究结果
1. Rosa26基因座敲入全长人类c-KIT基因组区域
研究首先在Rosa26安全位点验证策略可行性，将约100 kbp的人类c-KIT（hKIT）基因组区域成功敲入小鼠ES细胞。实验显示，Cas9-RNP辅助下敲入效率达30.2%，且多数克隆为单拷贝整合。免疫荧光证实hKIT蛋白在ES细胞中表达，表明人类基因可在小鼠细胞中正常翻译。
2. 小鼠c-Kit基因座的全长人源化
研究人员进一步将小鼠c-Kit基因座替换为人类同源序列。当使用3 kbp同源臂时，敲入效率提升至10%以上。人源化小鼠存活率符合孟德尔遗传规律，且hKIT基因在睾丸、肺等组织中呈现与人类相似的表达模式。尽管部分纯合子小鼠出现贫血和睾丸缩小，但其精子仍能通过体外受精（IVF）产生可育后代，证明人源化c-KIT可部分替代小鼠基因功能。
3. 超过200 kbp的APOBEC3基因簇人源化
人类APOBEC3基因簇包含7个串联基因，全长超过200 kbp。研究在BALB/c和C57BL/6N ES细胞中分别实现15.2%和10.6%的敲入效率，且无头尾串联插入。RNA-seq分析显示，人源化小鼠肺和脾脏中所有7个人类APOBEC3基因均表达，且表达谱与人类组织高度相关。值得注意的是，相邻基因Cbx6在肺中表达下调，提示大片段替换可能影响邻近基因调控。
4. 人源化等位基因疾病建模
研究还将X连锁CYBB基因人源化，并引入慢性肉芽肿病（CGD）相关突变（T458G和A461△）。人源化CYBB在肺巨噬细胞中特异性表达，而突变型hCYBBMut小鼠的粒细胞在PMA刺激下无法产生活性氧（ROS），成功模拟CGD的免疫缺陷表型。
结论与意义
TECHNO技术通过标准化分子生物学试剂和商业化BAC库，实现了93%人类基因的理论人源化范围。该平台不仅克服了传统方法对特殊酶系统或长同源臂的依赖，还首次在多小鼠品系中实现>200 kbp片段的高效敲入。人源化基因在体内重现人类剪切异构体和组织特异性表达，并支持配体-受体互作、免疫应答等生理功能研究。未来结合碱基编辑或引物编辑技术，可直接在活体小鼠中引入疾病相关突变，为遗传病机制研究和药物开发提供更精准的模型。
