《Nature Communications》：CD39 polymorphism enables lung thrombosis in sickle cell disease
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本研究针对为何仅有部分镰状细胞病(SCD)患者发生肺血栓这一临床难题，通过活体显微成像技术首次发现，肺血管内皮释放的CD39+细胞外囊泡(EVs)可通过降解ADP发挥天然抗血栓作用。研究人员揭示CD39基因(ENTPD1)多态性rs3176891A→G会导致CD39+EVs生成减少，从而增加SCD患者肺血栓风险。该发现为SCD血栓精准防治提供了新靶点。
镰状细胞病作为最常见的单基因溶血性疾病，困扰着全球数百万患者。尽管所有SCD患者都存在血管内溶血释放大量二磷酸腺苷(ADP)的现象——这种物质是强大的血小板激动剂，但令人困惑的是，仅有约20%的患者会发展为肺血栓栓塞。这种选择性易感现象背后的机制多年来始终成谜。
为解开这一谜团，匹兹堡大学血管医学研究所的Tomasz Brzoska和Prithu Sundd联合团队在《Nature Communications》发表了创新性研究。他们发现，肺血管内皮细胞释放的携带CD39蛋白的细胞外囊泡，如同血液中的"清道夫"，能快速降解ADP，从而阻止血小板聚集和血栓形成。然而，CD39基因上的一个微小变异——rs3176891A→G，会破坏这种保护机制，使得携带该变异基因的SCD患者更易发生肺血栓。
研究人员采用定量荧光活体肺显微技术(qFILM)，实时观测了ADP刺激下小鼠肺微循环的血栓形成过程。令人惊讶的是，虽然正常小鼠在ADP刺激后立即出现肺小动脉血小板富集血栓，SCD小鼠却受到天然保护。这种保护作用源于CD39的高效活性——当研究人员使用CD39抑制剂POM-1后，SCD小鼠也出现了明显的肺血栓。
进一步研究发现，SCD小鼠血浆中的细胞外囊泡数量是正常小鼠的两倍，且这些囊泡富含CD39蛋白，具有更强的ADP降解能力。通过成像流式细胞术，团队确认这些CD39+EVs主要来源于血管内皮细胞。在体外实验中，用血红素(hemin)处理人肺微血管内皮细胞(HMVECs-L)后，细胞释放的EVs中CD39表达和ADP酶活性显著升高，模拟了SCD患者的病理环境。
基于Walk-PHASST镰状细胞病注册研究和TOPMed数据库的遗传学分析显示，rs3176891G等位基因在发生肺血栓的SCD患者中频率显著更高(66% vs 52%)，且与肺血栓风险显著相关(优势比2.2)。而在一般非洲裔人群中，该变异与血栓风险无关，表明其致病作用具有SCD特异性。
在机制验证方面，研究人员发现，携带rs3176891G等位基因的SCD患者血浆中CD39+/CD31+EVs数量显著减少，ADP诱导的血小板聚集反应增强。相反，携带AA基因型的患者则表现出与SCD小鼠类似的ADP反应受损特征。
主要技术方法：研究采用Townes SCD小鼠模型，通过定量荧光活体肺显微技术(qFILM)实时观察肺血栓形成；利用尺寸排阻色谱法分离血浆细胞外囊泡，通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)和蛋白质印迹进行表征；采用成像流式细胞术鉴定EVs细胞来源；基于Walk-PHASST(n=437)和TOPMed(n=1,891)人群队列进行遗传关联分析。
ADP促进对照小鼠而非SCD小鼠的肺血栓形成
通过qFILM技术发现，静脉注射ADP可在对照小鼠中诱发肺小动脉血小板血栓，但在SCD小鼠中无此效应。SCD小鼠血浆中ADP诱导的血小板聚集受损，而胶原诱导的聚集正常，表明血小板功能本身无缺陷。
SCD小鼠对肺血栓的保护作用依赖CD39
CD39抑制剂POM-1处理可恢复SCD小鼠中ADP诱导的肺血栓形成和血小板聚集，证明CD39在保护机制中的核心作用。
血浆CD39+EVs阻止SCD中ADP依赖性血小板聚集
SCD小鼠血浆EVs数量更多、CD39表达和ADP酶活性更高。SCD来源的EVs可抑制ADP诱导的血小板聚集，且该效应可被POM-1逆转。
肺内皮产生循环CD39+EVs
成像流式显示SCD小鼠血浆中CD39+EVs共表达CD31、CD106(VCAM-1)和CD144(VE-钙黏蛋白)，证实其内皮来源。血红素刺激可促进人肺内皮细胞释放具有ADP酶活性的CD39+EVs。
ENTPD1 rs3176891G等位基因是SCD患者肺血栓的风险因素
遗传分析显示rs3176891G与SCD患者肺血栓风险相关，但在非SCD人群中无此关联。携带G等位基因的SCD患者血浆CD39+/CD31+EVs减少，ADP诱导的血小板聚集增强。
本研究揭示了细胞外囊泡介导的CD39依赖性机制在预防SCD肺血栓中的重要作用。在生理状态下，溶血释放的ADP通过激活血小板嘌呤能受体P2Y1和P2Y12促进血栓形成。然而，SCD的炎症环境同时诱导内皮细胞释放CD39+EVs，这些囊泡通过将ADP降解为AMP，发挥天然抗血栓作用。ENTPD1基因rs3176891G变异通过减少CD39+EVs生成，削弱这种保护机制，从而增加部分SCD患者的肺血栓风险。
该研究不仅阐明了SCD血栓异质性发生的分子机制，更重要的是为精准抗栓治疗提供了新思路。针对携带CD39风险变异的SCD患者，选择性抑制P2Y12受体可能成为有效的预防策略。这一发现对改善SCD患者预后具有重要临床意义，也为血栓性疾病的个体化防治提供了新范式。
