《Cell》：Myelin antigen capture in the CNS by B cells expressing EBV latent membrane protein 1 leads to demyelinating lesion formation
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本研究针对多发性硬化(MS)发病机制中B细胞的关键作用及与EB病毒(EBV)的关联这一科学问题，通过构建多种转基因小鼠模型，首次揭示了中枢神经系统(CNS)内髓鞘特异性B细胞直接捕获抗原后，EBV潜伏膜蛋白1(LMP1)可替代CD40L信号挽救B细胞免于活化诱导细胞死亡(AICD)，从而驱动抗体和补体依赖性脱髓鞘病变的新机制。该研究为理解MS发病的细胞分子基础提供了重要理论依据，发表于《Cell》杂志。
多发性硬化(Multiple Sclerosis, MS)作为一种中枢神经系统自身免疫性疾病，其发病机制一直是神经免疫学领域的重点难题。近年来，B细胞清除疗法的显著疗效和流行病学研究中与EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)感染的强关联性，共同将研究焦点指向了B细胞在MS病理过程中的关键作用。然而，一个核心问题尚未解决：EBV感染的B细胞是如何突破机体耐受机制，在MS病灶起始中发挥作用的？传统观点认为，自身反应性B细胞的活化主要发生在次级淋巴器官，但对于像髓鞘抗原这类主要存在于中枢神经系统内的自身抗原，B细胞在何处、以何种方式被激活并导致局部脱髓鞘，仍缺乏直接证据。
为了解决这一难题，来自瑞士巴塞尔大学医院的研究团队在《Cell》上发表了他们的最新研究成果。研究人员创新性地提出了一个假说：表达EBV潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein 1, LMP1)的髓鞘特异性B细胞，在浸润中枢神经系统后，能够直接从髓鞘膜上捕获自身抗原，而LMP1分子提供的组成性活化信号可以替代T细胞帮助，使这些B细胞免于正常的活化诱导死亡，进而分化为致病性细胞，驱动脱髓鞘病变的形成。
为了验证这一假说，研究人员综合运用了多种先进的实验技术。他们构建了多种抗原特异性B细胞转基因小鼠模型，包括针对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG)的MOG番茄小鼠、针对流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)的FluBI番茄小鼠以及针对水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)糖蛋白的V10番茄小鼠。通过活细胞成像技术实时观察B细胞与抗原表达细胞的相互作用；利用流式细胞术分析细胞表型和功能；采用酶联免疫斑点(ELISpot)技术检测抗原呈递功能；通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)解析脑内浸润B细胞的转录组特征；建立脑片共培养系统研究脱髓鞘过程；并对人源样本进行膜抗原捕获激活细胞分选(MACACS)和免疫组化分析。此外，研究还涉及了立体定向注射病毒感染、细胞过继转移、肢体使用不对称测试等行为学分析，以及针对补体沉积的免疫荧光染色等关键技术。
B细胞在组织中巡逻并原位捕获抗原
研究人员首先通过流式细胞术分析了健康野生型番茄小鼠各组织中的免疫细胞组成，发现B细胞存在于大多数器官，但在大脑中数量很少。为了研究B细胞直接捕获抗原的生理相关性，他们利用流感特异性FluBI B细胞与流感感染细胞共培养，通过活细胞显微镜观察到了B细胞与靶细胞接触后快速内化抗原的过程。体内实验进一步证实，在流感感染的小鼠肺部，抗原特异性B细胞能够更紧密地接触感染细胞并捕获抗原。这些结果提示，初始B细胞可以直接从组织中的抗原表达细胞捕获抗原，而不依赖于淋巴器官。
B细胞浸润大脑并捕获抗原
在实验动物中，B细胞在稳态下很少见，但在病毒感染后会浸润大脑。研究人员使用两种工程化的水疱性口炎病毒(VSV)制备物感染小鼠，观察到感染诱导了B细胞大量浸润大脑，最初进入血管周围间隙，7天后主要进入脑实质。通过V10番茄小鼠（其B细胞识别VSV糖蛋白）和活细胞成像，研究人员证实B细胞能够从感染神经元膜上提取抗原。体内双光子显微镜成像也直观展示了脑内B细胞与感染细胞接触并捕获抗原的过程。
更重要的是，当研究人员使用MOG番茄小鼠（其B细胞识别中枢神经系统限制性抗原MOG）重复实验时，发现这些自身反应性B细胞同样能够浸润病毒感染的大脑，并且只有从脑内分离的B细胞能够向MOG特异性T细胞呈递抗原，而从引流淋巴结或其他部位分离的B细胞则没有这种能力。这证明B细胞能够在非淋巴组织（包括大脑）中直接从抗原表达细胞捕获抗原。
抗原遭遇导致初始B细胞被删除
令人意外的是，尽管MOG反应性B细胞浸润大脑并捕获了抗原，研究人员并未观察到任何脱髓鞘现象。进一步分析发现，与野生型番茄B细胞相比，脑内MOG番茄B细胞数量显著减少，提示遭遇抗原的B细胞被特异性清除。流式细胞术分析显示，外周血中约90%的B细胞是MOG反应性的，但脑内还不到20%，支持自身抗原遭遇的B细胞通过活化诱导细胞死亡被快速清除的假说。
单细胞RNA测序分析揭示了更详细的细胞命运：在感染后第7天，脑内存在两个主要的MOG转基因B细胞群体——一个未成熟群体（可能位于脑膜）和一个生发中心样细胞群体。到第21天，生发中心样群体几乎完全消失，而这些细胞高表达TFEB调控的基因特征，与抗原暴露后的AICD密切相关。体外实验证实，B细胞需要同时暴露于抗原和获得T细胞帮助才能增殖，否则就会死亡。
大脑中B细胞捕获髓鞘抗原不会刺激T细胞反应
尽管体外实验表明T细胞帮助可以挽救抗原捕获的B细胞，但体内实验却发现，即使过继转移了MOG特异性2D2 T细胞，也未观察到实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的运动症状或脑内炎症病变。只有使用体外预激活的2D2 T细胞，才能在某些动物中诱导出EAE样症状，并增加脑内MOG反应性B细胞的比例。这表明初始T细胞无法有效挽救脑内抗原捕获的B细胞，可能需要其他信号或细胞类型的参与。
CD40L信号可以挽救抗原捕获的B细胞
由于T细胞帮助B细胞最重要的信号是CD40L，研究人员研究了这是否是脑内髓鞘反应性B细胞缺失的关键信号。体外实验表明，CD40L刺激可以模拟T细胞帮助的效果，独立于抗原促进B细胞存活。体内实验进一步证实，通过腺病毒载体在脑内表达CD40L，可以挽救MOG反应性B细胞，使其数量增加约三倍，并在B细胞浸润周围观察到局部脱髓鞘区域和IgM沉积。
单细胞RNA测序分析显示，CD40L信号特异性挽救了那些与近期抗原捕获和AICD命运相关的生发中心样B细胞群体。这些结果支持了假说：大脑中遭遇抗原的B细胞通常由于缺乏CD40信号而在BCR刺激后被AICD删除。
B细胞表达EBV蛋白LMP1可绕过CD40L检查点
鉴于初始T细胞无法有效挽救脑内髓鞘反应性B细胞，研究人员考虑了CD40L生存信号的其他来源。EBV是一个重要候选，其潜伏膜蛋白LMP1可作为组成性活化的CD40模拟物。研究人员构建了他莫昔芬诱导表达LMP1的MOG特异性B细胞小鼠模型，发现LMP1表达可以促进B细胞存活，而且与BCR刺激之间存在协同作用。
转录组分析显示，LMP1表达与CD40L信号在抗原捕获后24小时的转录影响非常相似。在小脑脑片培养实验中，表达LMP1的MOG反应性B细胞能够在1周内诱导广泛的脱髓鞘，而这一过程依赖于小胶质细胞的存在。
表达LMP1的MOG反应性B细胞脑浸润导致体内脱髓鞘
体内实验表明，与仅表达番茄荧光蛋白的B细胞相比，表达LMP1的MOG反应性B细胞在脑内数量更多，并导致周围组织明显脱髓鞘。病变周围可见补体成分C1q和C3d的沉积增加。此外，LMP1表达的B细胞能够存活更长时间，增强T细胞的脑内浸润和活化。
人类中观察到提议模型的相关组分
为了评估这一机制在人类中的可行性，研究人员从健康 donor 的外周血B细胞中筛选MOG特异性B细胞，发现这些细胞确实存在于健康人 repertoire 中，但频率很低，且均为IgM类型，免疫球蛋白基因为胚系状态，表明这群自身反应性细胞局限于初始区室。同时，在部分MS患者脑病变中观察到了表达LMP1的CD20阳性B细胞。
这项研究提出了一个MS病变起始的新模型，其中被EBV感染、表达LMP1的髓鞘反应性B细胞，在脑感染或外伤等导致血脑屏障暂时破坏的情况下进入CNS实质，直接识别并捕获髓鞘抗原。LMP1提供的生存信号使这些B细胞免于AICD，进而分泌自身抗体或通过抗原呈递激活T细胞，启动局部炎症和补体激活，最终导致脱髓鞘病变。这一模型很好地解释了B细胞清除疗法对MS的疗效、EBV感染与MS发病的强关联性，以及脑部感染和头部外伤增加MS风险的流行病学观察。
该研究的局限性在于，转基因表达LMP1的B细胞缺乏EBV感染人B细胞的许多特征，如长寿性和免疫逃逸能力；VSV感染模型也与生理性感染有所不同；且该模型未能直接解释MS发病率与人类白细胞抗原(HLA)基因型的关联，提示MS发病可能是一个多步骤过程。
总的来说，这项研究首次在实验动物中证实了EBV LMP1如何通过挽救脑内自身抗原特异性B细胞，驱动MS样脱髓鞘病变的形成，为理解MS发病机制提供了重要新视角，也为开发针对EBV的预防和治疗策略提供了理论依据。这些发现不仅对MS研究有重要意义，也对基础B细胞生物学有重要启示，提示B细胞可能像迁移性树突状细胞一样，在感染组织中充当抗原“侦察兵”的角色。
