《Cell》：EBV infection and HLA-DR15 jointly drive multiple sclerosis by myelin peptide presentation
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本研究揭示了EBV（Epstein-Barr virus）感染如何与HLA-DR15（human leukocyte antigen-DR15）协同驱动多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的新机制。研究人员发现EBV感染可改变B细胞的转录组和免疫肽组，导致髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）肽段通过HLA-DR15分子递呈，进而激活自身反应性CD4+T细胞。该研究为MS的病因学提供了重要理论依据，并为治疗策略开发指明了新方向。
多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种中枢神经系统（central nervous system, CNS）的慢性自身免疫性疾病，其特征包括自身免疫性炎症、轴突和神经元损伤、脱髓鞘和髓鞘再生、胶质细胞活化以及代谢改变。MS的病因涉及环境影响因素和遗传因素。EBV（Epstein-Barr virus）感染被认为是MS的重要环境触发因素，而HLA-DR15（human leukocyte antigen-DR15）单倍型则是MS最重要的遗传风险因素，两者协同可显著增加MS的发病风险。然而，EBV感染和HLA-DR15如何共同作用导致MS，其具体机制尚不完全清楚。
长期以来，科学界提出了多种EBV可能参与MS的机制，包括分子模拟（molecular mimicry），即EBV蛋白与髓鞘或非髓鞘MS自身抗原之间的交叉识别。此外，EBV感染会改变B细胞的转录谱，并诱导B细胞向CNS及其他组织迁移。关于MS中的自身反应性T细胞应答，目前尚不清楚EBV诱导的B细胞变化如何发挥作用，但EBV与自身肽之间的分子模拟是目前最受认可的机制。
尽管大多数人都感染了EBV，但仅有约千分之一的人会发展为MS。因此，除EBV感染外，其他因素特别是遗传易感性也必须参与MS的发生。其中，HLA-DR15单倍型最为重要，可能占MS总遗传风险的60%。HLA-DR15分子DRA01:01/DRB5 * 01:01（DR2a）和DRA01:01/DRB1 * 15:01（DR2b）可向T细胞受体（T cell receptors, TCRs）递呈肽段以激活CD4+T细胞，这与MS是CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病的事实一致。
EBV在B细胞中建立潜伏感染，驱动其活化和分化，同时改变其转录组，包括多个MS风险基因和自身抗原的表达。本研究旨在探究EBV相关的转录改变如何改变免疫肽组（immunopeptidomes），即EBV感染的B细胞和MS脑组织中由两种HLA-DR15异形体DR2a和DR2b所递呈的肽段，以及这些改变是否与MS相关。
由于在潜伏感染期间，EBV感染的B细胞非常罕见，无法直接分离和分析，研究人员采用了广泛使用的潜伏EBV感染模型，即用EBV感染原代B细胞以在体外生成EBV转化的B细胞系（EBV_B cells），这可能模拟无症状的原发感染。EBV转化的B细胞在体外表现出潜伏III期程序的特征，该程序以所有EBV潜伏基因（如EBNA1/2/3和潜伏膜蛋白1/2 LMP1/2）的表达为特征。因此，本研究使用EBV转化的B细胞系作为EBV潜伏状态的替代模型。
研究人员首先检测了EBV感染如何改变B细胞由HLA-DR15分子递呈的免疫肽组。他们从3名HLA-DR15+复发缓解型MS（relapsing-remitting MS, RRMS）患者中生成了EBV_B细胞。与之前报道一致，EBV_B细胞的转录组与原代B细胞（primary_B cells）存在显著差异，蛋白酶体相关基因显示最大程度的上调。EBV_B细胞中上调最多的基因在DNA复制/修复、代谢和氨基酸代谢过程中发挥作用，而下调基因则与自身免疫、过敏和寄生虫疾病以及B细胞受体信号传导和移植物抗宿主病相关。此外，EBV_B细胞显著增加了DR2a和DR2b分子的表面表达。随后，他们使用DR2a和DR2b特异性单克隆抗体特异性免疫沉淀EBV_B细胞中的两种HLA-DR15分子，洗脱结合的肽段，并通过基于质谱的测序进行分析。从DR2a和DR2b洗脱的肽段总数足够广泛，并且在原代B细胞和EBV_B细胞之间具有可比性。EBV_B细胞中来自DR2a和DR2b的独特肽段与原代B细胞相比有所增加，但差异不显著。推导出的DR2a或DR2b锚定位点p1、p4和p9（对于DR2a）或p1、p4和p7（对于DR2b）的氨基酸偏好性在原代B细胞和EBV_B细胞之间相似，但DR2a或DR2b递呈的独特肽段及其来源蛋白重叠有限，这表明与转录组变化一致，EBV感染也改变了HLA-DR15递呈的免疫肽组。
接下来，研究人员分析了EBV_B细胞特异性由HLA-DR15分子递呈的肽段。出乎意料的是，从主要髓鞘蛋白和MS自身抗原之一——髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）衍生出的四种肽段，即MBP(78-90)、MBP(83-90)、MBP(91-106)和MBP(91-114)，从所有三个EBV_B细胞样本的DR2a和/或DR2b上被洗脱出来，但在原代B细胞中未发现。尽管其他MS自身抗原，如αB-晶状体蛋白（CRYAB）、RAS鸟苷释放蛋白2（RASGRP2）和网状蛋白3（RTN3）在EBV_B细胞和/或原代B细胞中也在mRNA水平被检测到，但研究人员在DR2a或DR2b的免疫肽组中未发现来自这些蛋白的肽段。为了检验EBV_B细胞中HLA-DR15分子递呈MBP肽段是否与疾病状态相关，研究人员从4名HLA-DR15健康供者（healthy donors, HDs）中生成EBV_B细胞，并进行了转录组、蛋白质组和免疫肽组分析。他们未发现HDs和MS患者来源的EBV_B细胞在转录组和蛋白质组上存在显著差异，但DR2a或DRP2b递呈的独特肽段和来源蛋白的比较显示重叠有限，这可能归因于不同HDs或MS患者EBV_B细胞中DR2a和DR2b递呈肽段的个体间异质性。进一步地，他们仅在四份HD EBV_B细胞样本中的一份的DR2a递呈的免疫肽组中鉴定出上述四种MBP肽段中的一种，即MBP(78-90)。基于这些数据，研究人员目前认为EBV诱导的EBV_B细胞转录组和蛋白质组的变化在很大程度上是相似的，但不能排除HDs与MS患者EBV_B细胞免疫肽组存在差异。
为了识别MBP肽段的来源（研究人员假设为B细胞中的Golli-MBP），他们应用了聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）和蛋白质组学，并确实发现了Golli-MBP转录本以及仅存在于最长MBP异构体Golli区域（即脑异构体起始之前的N端部分）的肽段。他们还在原代B细胞和EBV_B细胞中通过蛋白质印迹检测到MBP蛋白，并且在EBV_B细胞中其水平显著较低，表明MBP在EBV_B细胞中通过改变的加工过程被降解。与抗原加工相关的酶，包括一些组织蛋白酶、几乎所有的内体蛋白酶（包括大量免疫蛋白酶体成员）以及ERAP1/2，在EBV_B细胞中上调，这些变化似乎在EBV感染后的第一天就开始在B细胞中发生。其中，蛋白酶体20S亚基β8（PSMB8）及其糜蛋白酶样切割最有可能在苯丙氨酸（F）89和90位点之后切割MBP。确实，在原代B细胞和EBV_B细胞中均在转录和蛋白水平检测到高PSMB8表达。在不同的加工途径中，包括蛋白酶体介导的消化、分子伴侣介导的自噬和自噬，后者被证明对于主要组织相容性复合体II类（major histocompatibility complex class II, MHC class II）分子加工和递呈自身及病毒抗原非常重要。一致地，自噬在EBV_B细胞中显著增加，这可能与PSMB8协同作用，在自噬溶酶体中降解MBP，并随后由HLA-DR15分子递呈MBP肽段。因此，这些EBV诱导的抗原加工和递呈改变可以解释在DR2a和DR2b上观察到细胞内蛋白来源肽段（包括MBP）的现象。
为了探究EBV_B细胞递呈的相同MBP肽段是否也在MS脑组织中递呈，研究人员分析了4名HLA-DR15+MS患者同时具有炎性脑膜和实质病变的脑组织中DR2a和DR2b递呈的免疫肽组。免疫肽组分析显示，DR2a或DR2b的氨基酸锚定偏好性与从EBV_B细胞洗脱的肽段相似，但脑来源的肽段在非MHC锚定位点富含碱性氨基酸。DR2a或DR2b递呈的独特肽段及其来源蛋白在EBV_B细胞和MS脑组织之间重叠有限。进一步地，研究人员发现了几种来源于在脑组织中特异性或高表达的蛋白的肽段，如MBP、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和成纤维细胞生长因子3（FGF3），以及许多来源于MBP和GFAP的DR2a和DR2b递呈的肽段。MBP来源的肽段分别占DR2a和DR2b递呈的免疫肽组的5.94%和5.32%，并且覆盖了最丰富的MBP脑异构体的几乎整个序列。有趣的是，四种EBV_B细胞洗脱的MBP肽段中的三种，即MBP(83-90)、MBP(91-106)和MBP(91-114)，也在MS脑组织来源的DR2a和DR2b递呈的免疫肽组中被检测到。研究人员目前尚不清楚脑中DR2a和DR2b分子上递呈的MBP肽段来自何处，但他们推测这些肽段是由常驻的小胶质细胞或吞噬了髓鞘碎片的巨噬细胞加工的。这一观点得到了仅发现来自脑异构体的肽段的观察结果的支持。考虑到MBP是众所周知的MS自身抗原，后续实验重点在于表征MBP肽段。
基于上述发现以及先前关于B细胞在MS中作为抗原呈递细胞（antigen-presenting cells, APCs）功能的报告，研究人员假设EBV感染使得HLA-DR15能够在B细胞上递呈MBP来源的肽段，随后激活外周自身反应性CD4+T细胞，这些T细胞然后可能识别脑中的MBP肽段并导致疾病。因此，他们首先测试了HLA-DR15+HDs和MS患者的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）对MBP肽段的反应。为了降低背景自体增殖，他们使用了去除CD45RA的（CD45RA-）PBMCs，其中包含单核细胞和记忆T细胞，但不包含B细胞和初始T细胞。他们测试了16名HDs和16名RRMS患者对单个或混合的MBP肽段的反应。14名HDs中的10名和15名RRMS患者样本中的14名对EBV EBNA1蛋白或肽段显示出强烈的反应性，表明既往有EBV感染，这与过去的报告一致。来自RRMS患者的CD45RA-PBMCs对单个肽段MBP(78-90)和MBP(83-90)以及肽段混合池均产生强烈的反应，而来自HDs的CD45RA-PBMCs很少反应。在16份RRMS样本中，8份对MBP肽段有反应，而8份没有反应。无反应的RRMS样本对包含23种来自甲型/乙型流感、破伤风、EBV和巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）肽段的病毒/细菌CEF II肽段混合池的反应也较弱。在增殖细胞（CFSEdim）中，记忆CD4+T细胞分裂最多。为了验证HLA-DR分子的递呈作用，他们使用了阻断性泛抗HLA-DR抗体L243。在5/8个对MBP肽段有反应的RRMS样本中，对MBP肽段混合池刺激的增殖可以被阻断，表明TCR和MBP肽段/HLA-DR复合物相互作用的参与。三个样本中缺乏阻断可能表明除HLA-DR外的其他HLA II类分子也可能递呈MBP肽段。对MBP肽段有反应的细胞分泌高水平的T辅助细胞1（T helper 1, Th1）细胞因子干扰素γ（interferon γ, IFN-γ），但不分泌其他Th细胞亚群的细胞因子。因此，促炎性的MBP肽段特异性CD4+T细胞存在于MS患者的外周血中，并且针对MBP(78-90)和MBP(83-90)。
接下来，研究人员感兴趣的是是否在CNS区室中也能发现对MBP肽段有反应的T细胞，并测试了三名HLA-DR15+MS患者脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）来源的CD4+T细胞的增殖情况，这些细胞已被作为群体进行扩增。CFSE稀释实验显示，来自三名个体中两名的CSF CD4+T细胞对MBP(78-90)和MBP(83-90)有反应，一名个体对MBP(91-106)和MBP(91-114)有反应。因此，识别MBP肽段的自身反应性CD4+T细胞同时存在于MS患者的外周血和CSF中。虽然仍是初步的，但对MS脑组织样本的免疫组织化学研究显示，所有四个用于免疫肽组分析的脑组织中EBV潜伏蛋白EBNA2、LMP1和/或结构蛋白gp350染色呈阳性，这表明存在EBV感染以及病毒感染的B细胞迁移到CNS区室，这与最近的一项研究一致。因此，研究人员假设后者可能参与刺激脑中的EBV特异性和/或MBP肽段特异性T细胞。
胸腺中高亲和力自身反应性T细胞通过阴性选择进行克隆删除是中枢耐受的关键机制，而阴性选择依赖于自身抗原在胸腺中的表达。之前的几项研究已经证实了MBP在人类胸腺中的表达。研究人员因此检测了胸腺APCs中MBP的表达。确实，MBP在胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells, TECs）中表达，但在骨髓来源的APCs中表达更高，包括胸腺B细胞、胸腺树突状细胞（dendritic cells, DCs）和胸腺巨噬细胞（macrophages, Mos）。一些在其他脑组织中特异性或仅发现的其他基因在胸腺中也有不同程度的表达。为了探究MBP(78-90)和MBP(83-90)是否在胸腺中由DR2a和DR2b递呈，研究人员分析了4名HLA-DR15+HDs胸腺组织中由DR2a和DR2b递呈的免疫肽组。从DR2a洗脱的肽段更多（平均3500个），从DR2b洗脱的较少（平均1150个）。胸腺中DR2a和DR2b递呈的肽段，其推导出的DR2a或DR2b锚定位点的氨基酸偏好性与来自EBV_B细胞和MS脑组织的肽段相似，但在其他位置的差异暗示了这些样本中不同的肽段来源。确实，DR2a/DR2b递呈的独特肽段及其来源蛋白在胸腺组织与原代B细胞/EBV_B细胞/MS脑组织之间重叠有限。与胸腺的中枢耐受诱导功能一致，胸腺来源肽段的来源蛋白广泛分布于人体各组织中。对胸腺来源肽段的详细分析显示，MBP(78-90)和MBP(83-90)均不在DR2a和DR2b递呈的免疫肽组中。除了RGF1A(270-294)，研究人员未在胸腺中检测到来自脑组织特异性表达蛋白的任何肽段，这表明识别MBP(78-90)/MBP(83-90)-HLA-DR15复合物的CD4+T细胞可能未在胸腺中被删除，并可在外周被EBV_B细胞激活。
除了MS，EBV感染还与其他人类自身免疫性疾病相关，如类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）、强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）和自身免疫性肝炎。有趣的是，类似于MBP(78-90)和MBP(83-90)对于MS，SLE和AS相关的自身抗原来源的肽段，如DEK原癌基因（DEK）(349-357)和整合素αIIB（ITA2B）(953-969)，可以从EBV_B细胞中洗脱，但不能从胸腺组织或原代B细胞中洗脱，这意味着EBV感染也可能有助于B细胞递呈来自其他自身抗原的肽段，并参与SLE和AS的发生/持续。
髓鞘特异性CD4+T细胞被认为在MS的发病机制中很重要，并且大量证据支持MBP(83-99)的免疫显性，以及其与多种HLA-DR分子（包括DR2a和DR2b）的混杂结合。与研究人员从先前关于MBP(83-99)加工的数据中预期的不同，他们在EBV_B细胞和MS脑组织的DR2a和DR2b递呈的免疫肽组中均未发现MBP(83-99)。他们之前已经表明，与HLA-DR15分子的结合保护MBP(83-99)免受切割。因此，该区域的所有肽段都在89和90位的两个F残基之后被切割是高度令人惊讶的。由于MBP(83-99)特异性CD4+T细胞克隆（T cell clones, TCCs）可以识别截短版本的MBP(83-99)肽段，研究人员想知道MBP(83-99)和MBP(78-90/83-90)特异性T细胞识别是否不同，并用两种较短的、天然递呈的肽段测试了两个特征明确的MBP(83-99)特异性自身反应性CD4+TCCs：TCC3A6（DR2a限制性）和TCC5F6（DR2b限制性）。TCC3A6和TCC5F6均不对MBP(78-90)和MBP(83-90)产生反应，也不对MBP(91-114)产生反应，表明MBP(78-90)和MBP(83-90)代表了与MBP(83-99)不同的CD4+T细胞表位，尽管它们可能有一个共同的朝向N端的核心表位。为了进一步检验这一点，研究人员用包含MBP(78-90)、MBP(83-90)、MBP(91-106)和MBP(91-114)的MBP肽段混合池刺激4名RRMS患者的CD45RA-PBMCs以生成TCCs。所有4个样本的记忆CD4+T细胞都对MBP肽段混合池有反应，尽管强度不同。然后，他们从RRMS-2生成了四个CD4+TCCs，并从RRMS-13、-17和-18各生成了一个。与CD45RA-PBMCs在MBP肽段混合池刺激后上清液中高水平的IFN-γ一致，所有新的TCCs主要表现出Th1表型。在评估它们的精细特异性时，所有新的CD4+TCCs都对MBP(78-90)和MBP(83-90)产生强烈反应，没有一个TCC对免疫显性的MBP(83-99)和MOG(35-55)产生反应。这些数据表明MBP(78-90)和MBP(83-90)的识别方式与MBP(83-99)不同，并且代表了MS中两个潜在的CD4+T细胞自身抗原。由于对C端肽段MBP(91-106)和MBP(91-114)的反应弱得多，研究人员没有进一步研究这些。
为了进一步检验HLA-DR15作为MS中两种MBP肽
