EB病毒与ANO2交叉反应性T细胞在多发硬化症中的致病机制及临床意义

《Cell》：Anoctamin-2-specific T cells link Epstein-Barr virus to multiple sclerosis

本综述系统阐述了Epstein-Barr病毒（EBV）核抗原1（EBNA1）与钙激活氯通道蛋白2（ANO2）之间的分子模拟机制在多发性硬化（MS）发病中的关键作用。研究通过单细胞测序、动物模型和临床样本分析，揭示了EBNA1特异性CD4+T细胞与ANO2的交叉反应性，证实这种交叉反应可加剧实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）严重程度。研究发现ANO2在小脑、下橄榄核和隔区血管内皮高表达，为理解MS的免疫病理机制提供了新视角。

　　

T细胞反应靶向ANO2并在MS中升高

研究采用抗原偶联磁珠刺激结合干扰素（IFN）γ/白细胞介素（IL）-17A/IL-22 FluoroSpot技术，检测多发性硬化（MS）患者对ANO2的T细胞反应。结果显示，未经治疗的MS患者（MS-Un）和那他珠单抗治疗的MS患者（MS-Nat）对ANO2_79-168的T细胞反应显著高于健康对照（HC）和其他神经系统疾病（OND）患者。特别是MS-Nat患者对ANO2_79-168的IL-17A和IL-22反应明显升高。受体操作特征（ROC）分析表明，基于IFNγ/IL-17A/IL-22对ANO2_79-168的反应可有效区分MS患者与对照。

ANO2不同区域的T细胞反应在MS患者中升高且主要为CD4⁺IFNγ⁺

研究进一步检测了ANO2其他区域（ANO2_1-275、ANO2_409-525和ANO2_750-1,003）的T细胞反应。发现MS-Un和MS-Nat患者对这些区域的T细胞反应均高于OND和HC。细胞内细胞因子染色（ICS）和流式细胞术证实了FluoroSpot结果，MS-Nat患者中ANO2特异性CD4⁺IFNγ⁺T细胞数量显著增加。相关性分析显示ANO2 T细胞反应与EBNA1反应呈正相关，而与巨细胞病毒（CMV）反应无相关性。

ANO2抗体和T细胞反应在MS患者中相关

对713例MS患者和722例对照的血浆样本进行分析，发现MS患者中针对ANO2_134-153（与EBNA1_430-440有同源性）的抗体水平显著升高。在MS-Nat患者亚组中，ANO2_79-168IFNγ⁺T细胞反应与抗ANO2_135-149IgG呈正相关。

ANO2_1-275和EBNA1_380-641免疫可在体内引发交叉反应性CD4⁺T细胞反应

在C57BL/6、非肥胖糖尿病（NOD）和SJL/J小鼠中，ANO2_1-275或EBNA1_380-641免疫可诱导强烈的CD4⁺T细胞和IgG反应，并存在交叉反应。特别是在SJL/J小鼠中，ANO2_1-275免疫可引发对EBNA1_380-641的交叉反应性T细胞反应，反之亦然。

ANO2_1-275预免疫导致EAE严重程度增加

在SJL/J小鼠中，预先免疫ANO2_1-275再诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），可导致疾病严重程度增加，表现为EAE评分升高、疾病持续时间延长、累积残疾评分增加和复发频率增高。ANO2_1-275/PLP免疫小鼠脊髓中CD4⁺T细胞数量显著增加，并趋向有更高的中性粒细胞和单核/巨噬细胞。

成年小鼠ANO2_1-275预免疫诱导非典型EAE表型

在6月龄成年SJL/J小鼠中，ANO2_1-275预免疫导致更多小鼠出现非典型EAE表型，特征为下行性瘫痪、协调障碍、平衡失调和痉挛样发作。免疫荧光染色显示ANO2_1-275组小鼠中枢神经系统（CNS）脱髓鞘显著增加，海马区激活的小胶质细胞/巨噬细胞（Iba1⁺）增多。

ANO2在血管内皮中共定位CD31，并在小鼠小脑、ION和隔区表达

RNAscope和iDISCO三维成像显示，Ano2转录本和蛋白在小脑、下橄榄核（ION）和隔区表达。ANO2与CD31有明显的血管共定位模式，在小脑、隔区和ION的共定位率分别为76%、85%和72%。

过继转移ANO2特异性T细胞导致ANO2高表达区域血浆外渗

过继转移MOG特异性T细胞联合ANO2特异性T细胞（均GFP阳性）到GFP阴性小鼠，发现在EAE发病时，ANO2 T细胞可追踪到小脑和颈髓，这些区域此前观察到血浆外渗和ANO2表达。单独转移ANO2特异性T细胞既不诱发疾病，也不引起血脑屏障（BBB）渗漏。

ANO2特异性T细胞可直接靶向表达ANO2的胶质细胞

体外共培养实验显示，ANO2特异性静息T细胞可诱导成熟少突胶质细胞（MOLs）和少突胶质前体细胞（OPCs）的caspase-3/7激活，表明具有直接杀伤作用。而星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞仅早期出现短暂的caspase-3/7信号，未导致靶细胞数量减少。

交叉反应性ANO2和EBNA1 TCRVβ CDR3b链在独立数据集中重叠

单细胞T细胞受体（TCR）测序显示，55个EBNA1/ANO2交叉反应性TCR克隆型中，有20个在其他已发表的MS患者血液和脑脊液TCR repertoire数据集中检测到。这些交叉反应性T细胞不具有保守的氨基酸序列相似性，表明其TCR repertoire具有多样性。

EBNA1和ANO2反应性T细胞具有不同的细胞毒性和活化表型

单细胞转录组分析将抗原特异性CD4⁺T细胞分为7个亚群："活化型"、"慢性细胞毒性型"、"细胞毒性型"、"炎症型"、"代谢型"、"非活化型"和"增殖型"。ANO2特异性和EBNA1/ANO2交叉反应性T细胞主要表现为活化型和细胞毒性型转录特征，高表达CXCR3、CCR6、颗粒酶和穿孔素等与CNS迁移和杀伤能力相关的分子。

讨论

本研究证实ANO2是MS中T细胞反应的重要靶点，且与EBNA1存在交叉反应。这种交叉反应性可能是EBV感染导致MS发病风险增加的重要机制之一。ANO2在CNS血管内皮的特异性表达，为理解免疫细胞如何靶向CNS提供了新线索。研究为开发针对EBV-ANO2交叉反应性T细胞的免疫治疗策略提供了理论基础。