海洋多糖裂解酶新发现：PL40家族Uly1040的双域结构及其独特His/Tyr催化机制解析

《Applied and Environmental Microbiology》：Structural and functional insights into Uly1040, an ulvan lyase from polysaccharide lyase family 40

本研究首次报道了来自海洋细菌Alteromonas macleodii的新型PL40家族ulvan裂解酶Uly1040，该酶采用前所未有的双域结构（N端(α/α)6环状结构域与C端反平行β-片层结构域）和独特的His/Tyr催化机制。研究发现Mn2+-His487-Asp358三元系统激活His485作为催化碱基，Tyr305作为催化酸，揭示了PL40家族在海洋环境中的保守性及生态重要性，为海洋生物质利用提供了新酶学基础。

　　

序列分析与新型PL40家族成员Uly1040的纯化

从海兔肠道分离的Alteromonas macleodii菌株HT-3基因组中发现ulvan利用基因簇（UUL_HT3），其中包含新型ulvan裂解酶基因Uly1040。该酶由856个氨基酸组成，系统发育分析确认其属于PL40家族，与已知酶P10_PLnc序列一致性达30.61%。重组Uly1040经纯化后显示为约97 kDa的单体蛋白。

Uly1040的酶学特性表征

Uly1040对ulvan具有严格底物特异性，最适作用条件为40°C和pH 7.0，且在35°C以下保持稳定。不同于典型海洋来源裂解酶，Uly1040活性随NaCl浓度升高而下降，反映其宿主肠道低盐适应性。降解产物分析表明该酶以内切方式切割ulvan，主要生成不饱和二糖ΔRha3S（m/z 401）。

Uly1040的整体结构解析

晶体结构显示Uly1040具有独特双域架构：N端(α/α)₆环状结构域（残基27-430）和C端反平行β-片层结构域（残基444-856）。结构比对发现其与PL12、PL15、PL17、PL39家族多糖裂解酶具有相似域组合，但区别于已知PL24/PL25（β-螺旋桨折叠）和PL28（β-果冻卷折叠）ulvan裂解酶。活性腔位于双域界面，并检测到Mn²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Ca²⁺等金属离子。

Uly1040催化活性的关键残基

通过保守性分析与分子对接，发现Asn245和Trp246负责+1位点GlcA羧基电荷中和，His485（催化碱）和Tyr305（催化酸）构成核心催化对。突变实验证实His485的激活依赖Mn²⁺-His487-Asp358氢键网络，该机制与PL39家族藻酸盐裂解酶Dp0100高度相似。二级结构分析表明突变体构象保持完整。

Uly1040的催化机制提案

提出三步骤催化模型：1）Asn245/Trp246中和C-6羧基负电荷；2）Mn²⁺-His487-Asp358系统激活His485夺取C-5质子；3）Tyr305质子化糖苷键促使断裂。该His/Tyr机制区别于PL24（双His）、PL25（Tyr/His）和PL28（底物依赖性催化）家族的代表性机制。

PL40家族ulvan裂解酶的保守机制与海洋分布

系统发育分析显示PL40成员主要分布于拟杆菌门（92.6%），关键催化残基（Asn245/Tyr305/Asp358/His485）在跨菌门序列中严格保守。海洋宏基因组数据证实Uly1040同源酶在太平洋与大西洋广泛存在，其分布与Ulva藻类地理记录高度重合，提示该家族在海洋碳循环中的全局作用。

结论

本研究首次揭示了PL40家族ulvan裂解酶的双域结构和His/Tyr催化机制，阐明金属离子介导的催化碱激活新范式。生物信息学分析证明该机制在PL40家族中具有保守性和海洋环境普适性，为海洋多糖降解的酶学基础与微生物碳循环研究提供了重要理论突破。