基于脂肪酶的HKUST-1（铜）生物复合材料作为毛细管电色谱中用于对映体分离的手性固定相

《Analytica Chimica Acta》：Lipase-based HKUST-1 (Cu) biocomposites as chiral stationary phase for enantiomer separation in capillary electrochromatography

高效手性分离材料开发：基于MOF的酶原位封装与毛细管电色谱联用技术。

　　

唐梦雪|张佳乐|穆启轩|陈凯岩|纪一兵

中国药科大学分析化学系，南京，210009，中国

摘要

背景

对映体在生物效应、药理活性和毒性方面可能存在差异。目前，全球监管机构对单一对映体药物的要求日益严格。随着手性药物市场的持续增长，开发手性分离技术成为一项紧迫的科学任务。因此，手性药物对映体的分离和分析直接关系到人类健康。基于酶的手性固定相（CSP）是一个有前景的平台。不幸的是，天然酶的脆弱性以及制备过程的复杂性和低效率阻碍了其在手性分离中的实际应用。

结果

金属有机框架（MOFs）在酶固定化和毛细管电色谱（CEC）分离领域具有巨大潜力，被探索作为具有良好酶固定性能和支持分离能力的CSP。脂肪酶（来自猪胰腺）在“原位”概念下被封装到金属有机框架（MOF）中。有效的酶负载能力使复合材料（Lipase@HKUST-1）继承了脂肪酶的天然手性识别能力。基于这一概念，Lipase@HKUST-1直接在开放柱中生长用于毛细管电色谱（CEC）。通过优化界面组合方法和简化柱制备步骤，有效提高了毛细管柱的制备效率和性能。实现了萘普生和氯苯那敏等多手性药物的对映体分离。理论计算进一步探讨了潜在的手性识别机制。

意义

成本效益高的脂肪酶（来自猪胰腺）与MOF材料的有效结合丰富了用于对映体分离的手性材料库。对手性识别机制的理解为设计理想性能的材料提供了灵感。高度稳定的MOF分离平台为OT-CEC的CSP发展引入了开创性的研究范式。

引言

手性药物的不同对映体在体内可能表现出各种生物效应，这深刻影响着人类的生活、健康和安全[1]、[2]。高效的手性分离平台将为探索不同对映体在体内的生理效应提供基础。在这方面，毛细管电色谱（CEC）无疑是理想的候选方法[3]、[4]、[5]。它通过结合电泳的高分离效率和色谱相互作用的选择性，已成为手性分离分析中的有效手段。迄今为止，包括环糊精[6]、[7]、氨基酸及其衍生物[8]、冠醚[9]、[10]等在内的手性选择剂已被用于CEC中的手性固定相（CSP）的开发。然而，手性选择剂的种类有限，难以应对日益多样的手性药物。这促使研究人员不断探索新型CSP以提高手性分离的效率和实用性。由于酶由手性亚单位组成，并具有固有的两亲性和两性离子特性，能够提供特定的相互作用，因此有望承担这一挑战性任务[11]、[12]。作为在不对称催化领域取得显著进展的代表性生物分子，脂肪酶作为理想的手性分离平台具有潜力。此外，与市场上昂贵的脂肪酶相比，来自猪胰腺的脂肪酶具有显著的成本优势。这种酶可以催化对硝基苯酯的水解生成对硝基苯酚，可通过CEC在线检测，为评估柱固定化提供定量指标[13]、[14]。

不幸的是，由于脂肪酶是由氢键和范德华力等弱相互作用形成的动态大分子，其操作稳定性和重复使用性较低，限制了其在这一领域的发展[15]。酶的固定化为克服这一严峻挑战提供了有效解决方案[16]、[17]。该领域的最新研究方向是利用具有良好结晶性、高孔隙率和可调功能性的多孔材料，如共价有机框架（COFs）[18]、[19]、金属有机框架（MOFs）[20]、[21]、[22]和氢键有机框架（HOFs）[23]、[24]，在其外表面构建“保护性框架”。与其他两种多孔材料相比，MOFs结合了分散性和稳定性。通过将它们用作外骨骼并通过密集的框架形成“屏障”，可以通过空间位阻维持酶的构象稳定性，从而支持脂肪酶的构建并提高其稳定性[25]。因此，尝试将它们与MOF材料结合，利用其固有的手性分离能力直接功能化MOF材料，以实现稳定性和分散性的平衡，可能为CEC中CSP的发展提供新的选择。

基于此，本文构建的MOF在大分子固定系统中具有独特优势，包括但不限于单体良好的水溶性、温和且快速的合成条件以及出色的整体材料分散性和稳定性[26]。这也使得可以在毛细管的狭窄内部环境中原位使用MOF材料和酶制备CSP。构建的HKUST-1基于三聚酸和硝酸铜作为MOF构建单元，聚维吡咯烷酮（PVP）和半胱氨酸（Cys）作为调节剂。关键原理在于加速蛋白质周围预成核簇的形成，形成蛋白质/PVP/Cys自组装[27]。来自金属硫蛋白的金属阳离子积累模式可以通过Cys和金属阳离子之间的配位相互作用积累金属阳离子，从而加速预成核簇的形成和蛋白质周围的MOF生成[28]。PVP用于帮助酶在溶液中的分散和稳定性，是一种类似于蛋白质的生物相容性大分子，可以适应Cys在酶表面的富集。丰富的酰胺基团可能有助于形成氢键，引导氨基酸向蛋白质靠近。通过与Cys上的巯基促进配位，与使用质子酸相比，Cys创造了温和的反应环境，最大化了酶的生物活性，同时实现了MOF的原位封装[29]、[30]。

在这项工作中，我们探索了基于脂肪酶的HKUST-1（Cu）生物复合材料作为CEC中的CSP用于对映体分离。我们成功开发了一种基于原位封装策略的新类型CSP，并通过“原位”概念直接在OT柱中生长复合材料，有效简化了色谱柱的制备步骤。这项研究巧妙地利用了MOFs的纳米孔作为“屏障”，为酶提供了稳定的固定平台；同时，酶具有丰富的有效手性识别结合位点，赋予MOFs出色的手性分离能力。这种协同效应实现了CEC中对映体分离的高稳定性和选择性，为手性分离提供了新颖而强大的平台。开发的CSP已用于扩展手性分离目标，包括氨基酸对映体、手性醇和手性药物，并建立了基于手性分离催化产物定量峰面积的在线评估方法。理论计算方法为理解脂肪酶的手性分子识别过程提供了理论支持，并揭示了可能的相互作用模式。该策略具有一定的可扩展性，对手性来源和固定载体的双重可控性为分离材料的设计和快速构建高效手性分子分离平台提供了可能性。

实验试剂和设备

1,3,5-苯三聚酸（BTC，97%）和硝酸铜（Cu(NO₃)₂（98%）、聚维吡咯烷酮（PVP）和半胱氨酸（Cys，99%）购自腾谦生物科技有限公司（上海，中国）。3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，97%）和戊二醛（25%）由Aladdin公司（上海，中国）提供。磷酸（85.0%）、乙酸（99.5%）、乙醇（99.8%）和十二水合磷酸二钠（85%）由南京化学试剂有限公司（南京，中国）提供。

材料合成和表征

脂肪酶@HKUST-1用于手性识别，采用室温下水中的一锅法快速合成。脂肪酶可以特异性催化对硝基苯酯的水解生成对硝基苯酚，其在紫外可见吸收光谱中在400 nm处表现出特征吸收峰。因此，可以通过监测吸光度来评估脂肪酶的有效固定。对照实验的差异完全验证了有效引入和

结论

总结来说，我们采用了原位封装酶固定化策略结合原位生长柱技术。使用HKUST-1作为载体和脂肪酶作为功能单元，构建了具有高结晶度和良好分散性的Lipase@HKUST-1。基于仿生矿化原理，通过Cys巯基和Cu²⁺的强配位作用，金属离子被定向诱导富集在酶分子表面，推动原位

CRediT作者贡献声明

唐梦雪：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件、形式分析、数据管理、概念化。张佳乐：验证、软件、数据管理、概念化。穆启轩：验证、研究、形式分析。陈凯岩：可视化。纪一兵：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、项目管理、资金筹集

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可在本文的补充材料中找到。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了江苏省的研究生研究与实践创新计划（KYCX25_1072）的支持。