基于杂交链反应（HCR）扩增和磁富集技术的超灵敏电化学发光适配体传感器，用于检测肝素结合蛋白

《Analytica Chimica Acta》：Ultrasensitive electrochemiluminescence aptasensor for heparin-binding protein based on hybridization chain reaction (HCR) amplification and magnetic enrichment

高效电化学发光aptasensor开发及HBP检测研究

　　

程梦欣|徐万鑫|曹莹莹|林月|张胜航|罗芳|邱斌|林振宇

中国福建省福州市福州大学化学学院食品安全与生物分析科学重点实验室、食品安全与健康分析与检测技术重点实验室，邮编350116

摘要

背景

肝素结合蛋白（HBP）是一种多功能阳离子蛋白，在中性粒细胞激活时会在感染或炎症反应中迅速释放。它在免疫调节和血管通透性方面起着关键作用，并且最近被作为一种有前景的生物标志物用于败血症的早期诊断。然而，传统的基于抗体的免疫测定方法检测HBP通常成本较高、稳定性差且操作繁琐，这限制了它们的临床应用。因此，开发灵敏、低成本且用户友好的传感策略以实现快速准确的HBP定量是非常必要的。

结果

在本研究中，通过整合适配体识别、磁富集和杂交链反应（HCR）放大技术，开发了一种电化学发光（ECL）适配体传感器，用于超灵敏地检测HBP。当HBP与其适配体特异性结合时，固定在磁珠上的触发序列被激活，从而引发HCR反应，形成能够与大量三(1,10-菲咯啉)钌(II)（Ru(phen)₃²⁺）小分子结合的长双链DNA（dsDNA）结构。这一放大过程显著增强了ECL信号，而磁分离有效地去除了未结合的成分，降低了背景噪声。在优化条件下，该适配体传感器能够在140 fM至140 nM的宽线性范围内定量检测HBP，检测限低至84.24 fM。

意义

所提出的ECL适配体传感器表现出优异的灵敏度、特异性和操作简便性，为精确检测HBP提供了一个可靠且高效的分析平台。由于其出色的分析性能、稳定性和微型化潜力，这种传感策略在早期败血症诊断和更广泛的临床生物标志物检测中具有显著的应用前景。

引言

肝素结合蛋白（HBP），也称为CAP37，是一种多功能阳离子蛋白，储存在多形核中性粒细胞的分泌颗粒中，并在感染或炎症反应激活时释放[1]。作为内皮通透性的关键调节因子，HBP促进了白细胞的迁移并放大了炎症信号级联反应，在先天免疫防御机制中起着关键作用[2]。临床上，血浆中HBP水平的升高与多种感染状况相关，尤其是在败血症中，其浓度与疾病严重程度和不良临床结果密切相关[3]。与传统炎症生物标志物（如C反应蛋白（CRP）[4]和前钙素原（PCT）[5]相比，HBP在早期检测细菌感染方面具有更高的灵敏度和特异性，使其成为早期诊断和风险分层的理想候选物[6]。鉴于其诊断和预后价值，开发可靠高效的HBP检测方法在分析化学领域引起了广泛关注[7]。目前，大多数HBP检测方法基于传统的免疫学技术，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]、新兴的干式免疫荧光测定[9]和乳胶免疫浊度法[10]，这些方法严重依赖于基于抗体的识别元件。然而，这些方法往往存在成本高、稳定性差和操作繁琐等局限性。最近，周等人成功筛选出了特异性HBP适配体，并利用该适配体构建了一种荧光适配体传感器，证明了无抗体平台在HBP检测中的应用[11]。这种基于适配体的传感策略具有显著的优点，包括更高的稳定性、更低的成本和简化的检测程序[12],[13],[14]，在临床诊断中实现快速、灵敏和经济的HBP检测具有巨大潜力。由于复杂生物样本中目标分子的数量极低，通常需要使用信号放大策略来确保准确检测。此外，必须有效减少非特异性信号和基质相关干扰，以实现可靠的检测结果。仍需进一步探索适配体在HBP检测中的应用。

电化学发光（ECL）是一种高度灵敏且应用广泛的分析技术，它结合了电化学过程的精确控制和发光检测的光学优势[15]。其主要优点之一在于背景信号极低，因为发光是由电极界面产生的电化学反应而非外部光源激发[16],[17]，这有效消除了自荧光和光散射的干扰，从而显著提高了信噪比[18]。ECL具有极高的分析灵敏度，检测限可达到皮摩尔（pM）甚至飞摩尔（fM）级别，特别适合在疾病早期阶段检测微量生物标志物。

杂交链反应（HCR）是一种无酶的等温核酸扩增技术，近年来在生物传感和分子诊断领域受到了广泛关注[19]。HCR的主要优点之一是其高特异性：扩增过程仅在预定义的触发序列存在下启动，从而形成由重复单元组成的长DNA聚合物[20]。HCR生成的长双链DNA（dsDNA）结构为三(1,10-菲咯啉)钌(II)（Ru(phen)₃²⁺等小分子提供了丰富的结合位点[21],[22]。得益于静电吸引和π–π堆叠作用，Ru(phen)₃²⁺可以有效地嵌入dsDNA基质中[23]。同时，dsDNA框架还有助于核心反应物三丙胺（TPA）在电极界面的局部积累，从而在电化学激发下更有效地传递电子并生成激发的Ru(phen)₃²⁺状态[24]。此外，DNA微环境部分抑制了非辐射淬灭途径，从而显著增强了ECL信号。这种独特性质使得HCR与ECL的无缝集成成为可能，实现了显著的信号放大和检测灵敏度提升。这些策略已成功应用于核酸、蛋白质和其他临床相关生物标志物的超灵敏分析，显示出在疾病早期诊断中的巨大潜力。例如，张等人使用加热电极表面触发HCR，使Ru(phen)₃²⁺嵌入dsDNA的沟槽中，从而实现双酚A的ECL检测[25]。类似地，徐等人用DNA修饰了ITO电极表面，随后HCR生成的dsDNA吸附了游离的Ru(bpy)₃²⁺，从而实现了miRNA 21的ECL检测[26]。

磁富集和分离是一种高效策略，能够在外加磁场下快速从溶液中分离磁性物质[27]。这种方法可以有效区分结合在磁性载体上的信号生成探针和未结合的游离发光剂（如Ru(phen)₃²⁺），从而大幅降低背景干扰。当与HCR结合使用时，磁分离可以显著提高基于ECL的检测灵敏度并抑制非特异性信号[28]。这些技术的协同集成为构建高性能生物传感器提供了有力平台，提高了分析可靠性和诊断实用性。例如，李等人利用磁分离技术在检测系统中分离解离的DNA链，实现了miRNA-543的ECL检测[29]。徐等人进一步将磁分离与HCR扩增结合，用于miRNA-21的ECL检测[30]，而尤等人将该策略扩展用于金黄色葡萄球菌的ECL检测[31]。

HBP是一种重要的炎症生物标志物，在复杂的生物基质中通常以低浓度存在，其中许多共存成分可能造成显著的背景干扰。因此，灵敏且选择性地检测HBP仍然具有挑战性。这些特点突显了有效目标富集、背景抑制和信号放大策略的必要性。在本研究中，开发了一种基于磁富集和HCR放大的ECL适配体传感器，用于灵敏检测HBP。该检测方法依赖于适配体与目标HBP之间的特异性识别，这会触发结构变化。然后暴露固定在磁珠上的互补链上的触发序列，从而启动随后的HCR过程，形成长dsDNA结构。这些dsDNA产物为Ru(phen)₃²⁺提供了丰富的结合位点，从而实现有效的信号放大。同时，磁富集用于选择性分离负载有Ru(phen)₃²⁺的磁性复合物和溶液中过量的未结合发光剂，显著降低了背景信号。这也提高了检测特异性。由于结合了目标特异性识别、无酶信号放大和高效磁分离的优势，所构建的ECL生物传感器实现了高灵敏度和定量的HBP分析。所提出的策略在临床诊断应用中也显示出巨大潜力。

试剂和仪器

修饰有链霉亲和素的磁珠（SAMBs）购自Promega（北京）生物科技有限公司。二氯三(1,10-菲咯啉)钌(II)水合物[Ru(phen)₃²⁺和三丙胺（TPA）均购自Sigma-Aldrich（上海，中国）。磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液购自北京InnoChem科技有限公司。Tween-20购自国药化学试剂有限公司。适配体[11]和其他所用核酸的序列如下

肝素结合蛋白ECL适配体的工作原理

图1展示了本研究中开发的用于检测HBP的ECL适配体的工作原理。该策略结合了两轮基于磁珠的富集和一轮HCR扩增。如图1所示，互补DNA（cDNA）首先与适配体杂交形成cDNA-适配体复合物，然后通过链霉亲和素与生物素之间的特异性相互作用将其固定在链霉亲和素包覆的磁珠表面

结论

本研究开发了一种通过整合磁富集和HCR扩增来检测HBP的ECL适配体传感器。HBP与其适配体之间的特异性结合触发了适配体从磁珠上互补链的释放，从而启动HCR扩增并实现了初次信号增强。磁富集进一步去除了干扰物质并浓缩了发光探针，实现了二次信号放大。

CRediT作者贡献声明

林振宇：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。邱斌：验证、监督、概念构思。罗芳：可视化、项目管理、概念构思。张胜航：撰写 – 审稿与编辑、资源获取。林月：撰写 – 审稿与编辑、方法学。曹莹莹：可视化、资源提供。徐万鑫：验证、调查、数据分析。程梦欣：撰写 –

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22174018）、福建省科技创新联合资金（2023Y9267）和国家科技计划项目（2024L3020）的支持。