对受柴油污染的土壤进行序贯生物刺激和生物强化处理：对烃类降解及土壤细菌群落的影响

《Applied Soil Ecology》：Sequential biostimulation and bioaugmentation treatments of a diesel-contaminated soil: effect on hydrocarbon degradation and soil bacterial communities

本研究对比了土地耕作（LF）与生物通风（BV）结合营养添加和生物强化的联合修复策略，用于处理柴油污染土壤。经过180天实验，LF-NBA微宇宙使TPH减少40.8%，植物毒性显著降低，微生物群落以放线菌、α-变形菌和芽孢杆菌为主，并检测到降解烷烃的alkB基因。结果表明，生物刺激联合生物强化能有效改善污染土壤质量。

　　

帕勒莫大学工程系（DI），科学大道8号，90128，帕勒莫，意大利

摘要

1. 生物修复被认为是处理受污染土壤的一种安全、经济且环保的方法。在这项研究中，比较了两种好氧生物刺激工艺——土地耕作（LF）和生物通风（BV），这两种工艺都结合了营养物质（氮）的添加，并随后进行了生物强化（BA），以评估其对受污染土壤的修复效果。实验持续了180天，其中120天为生物刺激阶段，随后60天为生物强化阶段，使用了一组选定的能够降解碳氢化合物（HC）的放线菌。通过培养碳氢化合物以及16S rDNA Illumina-MiSeq测序技术，对微生物群落的多样性和组成进行了分析。经过180天的土地耕作、营养物质添加和生物强化后，使用气相色谱法（Gas-Chromatography FID）测得的总石油烃（TPH）含量减少了40.8%。通过植物毒性测试评估了处理后土壤的质量，结果显示植物毒性逐渐降低。受污染土壤中以酸菌、放线菌和α-变形菌为主。通过16S rDNA测序分离并鉴定了能够降解碳氢化合物的细菌。经过180天的处理后，观察到生物通风处理组中的放线菌、α-变形菌和杆菌数量增加，而土地耕作处理组中的TM7–3和γ-变形菌数量增加。在土地耕作和生物通风处理组中检测到的细菌中有超过40%属于能够降解碳氢化合物的菌属。分子研究表明，这些细菌含有编码烷烃单加氧酶的基因alkB，该酶参与烷烃的生物降解过程。

引言

1. 工业和石化活动造成的土壤污染是全球主要的环境问题之一，对人类健康有显著影响（Varjani等人，2020年）。根据环境保护署的数据，石油烃（HC）及其衍生物是欧洲45%自然环境中土壤污染的主要来源，而重金属则存在于35%的污染土壤中（Falih等人，2024年）。在意大利，碳氢化合物也是土壤污染的主要形式（占污染土壤的55%）（Di Trapani等人，2023年；Savarese和Falconi，2024年）。
2. 碳氢化合物污染对人类构成严重威胁，因为它们具有高毒性，并具有致癌、致突变和致畸作用（Maddela等人，2022年；Correia和Rasteiro，2025年），同时还会影响生态系统，对生物和非生物条件产生严重影响，进而对生物多样性造成破坏（Truskewycz等人，2019年；Wang等人，2021年）。此外，碳氢化合物污染会改变土壤的化学组成并降低养分可用性，从而导致土壤微生物群落的变化和细菌活性的抑制（Ossai等人，2020年；Elijah，2022年）。
3. 修复受碳氢化合物污染的土壤是一项紧迫的任务，目前已有许多基于物理化学和生物方法的技术被应用（Majeed等人，2025年）。
4. 大多数碳氢化合物化合物可以被环境微生物（主要是真菌和细菌）完全降解为二氧化碳和生物质，这些微生物具有特定的分解能力（Varjani，2017年），这些生物降解能力可以通过生物修复得到利用。
5. 生物修复策略利用不同的生物方法从受污染的土壤和水中去除污染物。生物修复可以在异地或原位进行，具体取决于实施地点。异地方法涉及挖掘受污染的土壤；原位方法则直接在污染现场进行处理，通常更具成本效益和环保性。越来越多的混合修复技术被应用，结合不同的生物修复方法来更有效地处理复杂的污染问题，提高污染物去除率、土壤恢复率和环境可持续性（Elijah，2022年）。最常用的原位生物修复技术是生物刺激和生物强化，或者这两种方法的组合（Mekonnen等人，2024年）。
6. 生物刺激旨在通过优化限制性环境参数（如氧气供应、营养物质添加、pH值和温度控制）来促进能够降解污染物的本土微生物的生长和活性（Ossai等人，2020年；Mekonnen等人，2024年）。
7. 生物强化涉及从待修复的基质中选择高效的碳氢化合物降解微生物（本土菌种）或从其他地点获取的微生物（外来菌种），并在大规模培养后将其接种到污染现场（Muter，2023年）。采用这种方法的理由是，在某些情况下，本土微生物的数量较少，或者无法降解复杂混合物中的多种碳氢化合物，或者由于污染而处于压力状态（Muter，2023年）。菌种可以是一个单一的细菌菌株，也可以是一个能够降解特定污染物的细菌菌群（Pandolfo等人，2023年）。多项研究深入探讨了碳氢化合物相关的微生物学特性，发现了越来越多能够降解碳氢化合物的微生物，这些微生物来自陆地或水生生态系统（Catania等人，2015年；Catania等人，2018年；Chernai等人，2019年；Djahnit等人，2019年；Chicca等人，2022年；Santisi等人，2022年；Mekonnen等人，2024年）。为了评估生物处理的可行性，需要了解受污染基质的特性、污染物的性质和浓度以及本土微生物群体的生物降解潜力（Kebede等人，2021年）。
8. 在设计原位或异地全规模处理方案之前，会在微宇宙中进行实验室生物处理可行性测试，以了解污染现场的具体特征（Wu等人，2024年；Sabaté等人，2004年；Mariano等人，2007年）。
9. 在生物刺激工艺中，土地耕作（LF）和生物通风（BV）已被证明是有效的解决方案，它们依赖于本土土壤微生物来修复受石油烃污染的土壤（Kebede等人，2021年；Iturbe-Espinoza等人，2023年）。土地耕作的特点是定期翻动受污染的土壤以增强氧气供应，从而刺激好氧微生物的活动。土地耕作通常用于修复容易被或中等程度可生物降解的低分子量石油烃污染的土壤（Wang等人，2016年）。其主要优点是成本较低且持续时间较短（通常在6-18个月范围内）。然而，处理效果严格取决于环境条件，且需要较大的处理面积。
10. 生物通风是一种原位处理方法，用于去除非饱和带中的可生物降解污染物（Anekwe和Isa，2024年）。通过注入井引入空气，并可能结合灌溉系统来调节土壤湿度和添加营养物质。与其它非饱和带处理方法相比，生物通风在经济上更具优势，同时避免了挖掘过程中处理污染物带来的风险。然而，这种技术要求土壤具有良好的气体渗透性，并可能导致更易挥发的污染物被带走。
11. 本研究的目的是在微宇宙尺度上比较结合营养物质（氮、磷和钾）的土地耕作和生物通风生物刺激方法以及随后的生物强化方法，以评估实际受柴油燃料污染的土壤的修复可行性。
12. 为了评估受污染土壤的生物降解潜力，首先在含有碳氢化合物作为唯一碳源的矿物培养基上分离出了能够降解碳氢化合物的本土细菌，并通过宏分类学和功能性关键分解基因的PCR扩增技术进行了检测。
13. 设置了基于生物刺激和顺序生物强化处理的多个微宇宙实验，还包括无菌对照实验。定期使用气相色谱法测量碳氢化合物浓度，并进行了毒性测试以评估处理后土壤的质量。
14. 经过120天的生物刺激后，对选定的微宇宙进行了生物强化处理，通过接种先前选定的具有降解中链和长链正烷烃能力的细菌菌群来提高生物降解活性（Quatrini等人，2008年；De Pasquale等人，2012年）。
15. 本研究的结果为结合生物刺激和生物强化的方法在修复受石油烃污染土壤方面的应用提供了有益的见解。

土壤特征

1. 土壤样本来自意大利中部的一个地点，该地点发生了柴油燃料的意外泄漏，导致表层土壤受到污染。这是一种沙质壤土，粘土和砾石含量较低，C10-C40碳氢化合物的浓度接近7200 mg/kgSS，并含有多种重金属。用于实验室测试的土壤样本的颗粒组成和物理化学特性如下所示

从受污染土壤和微宇宙中分离和鉴定碳氢化合物降解细菌

1. 从未处理的受污染土壤中，通过在添加十六烷作为唯一碳源和能源的矿物培养基上进行富集培养，获得了47株细菌分离株。根据菌落形态，选择了18株细菌进行分子鉴定。这些细菌属于Delftia和Hydrogenophaga（β-变形菌纲）、Pseudomonas和Stenotrophomonas（γ-变形菌纲）、Nocardia和Rhodococcus（放线菌纲）属（表3）。

讨论

1. 了解受污染土壤中的微生物分解潜力和群落组成对于生物修复策略至关重要。本研究评估了实际受柴油污染土壤的固有生物修复潜力，以及生物刺激结合通风和营养物质添加后进行生物强化的效果。

结论

1. 本研究的结果证明了一种有效的生物修复策略，即结合生物刺激和生物强化的方法可以用于修复受柴油污染的土壤。生物刺激-生物强化处理促进了能够降解碳氢化合物的本土微生物群落的富集。生物通风和土地耕作对微生物群落的变化有显著影响，但并未导致显著的生物降解速率差异。

CRediT作者贡献声明

Pietro Greco Lucchina：撰写原始草稿、方法学设计、数据管理、概念构建。 Valentina Catania：撰写原始草稿、方法学设计、数据管理、概念构建。 Daniele Di Trapani：撰写与编辑、原始草稿撰写、数据管理、概念构建。 Elisa Maria Petta：撰写与编辑、数据管理。 Laura Sciré Calabrisotto：撰写与编辑、数据管理。

利益冲突声明

1. 作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究的部分工作是在RETURN扩展合作伙伴关系框架下进行的，并获得了欧盟下一代欧盟（Next-GenerationEU，国家恢复与韧性计划 – NRRP，任务4，组成部分2，投资1.3 – D.D. 1243 2/8/2022，PE0000005）的资助。作者感谢Ruggero Filingeri工程师在微宇宙操作方面的宝贵帮助，感谢Rosa D'Addelfio小姐在总石油烃（TPH）测量方面的分析支持，以及Pablo Paquis Chester在PCoA方面的协助。作者衷心感谢ENI和ENIREWIND的支持。