利用西班牙苔藓内生菌缓解汞胁迫及促进植物生长的机理与应用研究

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Endophytic bacteria and fungi from atmospheric mercury bioindicator Tillandsia usneoides (Spanish moss) alleviate mercury stress and promote plant growth

本研究针对大气气态汞(Hg0)污染对生态系统的威胁，以大气汞生物指示植物西班牙苔藓(Tillandsia usneoides)为对象，系统探究了其内生细菌和真菌群落对Hg0胁迫的响应机制。研究发现，Hg0暴露显著降低了内生细菌的α多样性并改变了微生物群落结构，同时筛选出多个具有强Hg2+转化耐受能力的内生菌株。功能预测显示汞还原酶(MerA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等关键解毒酶表达上调。通过叶面接种实验证实，筛选菌株可有效缓解Hg0对拟南芥的生长抑制，增强生物量及根系发育，为微生物辅助植物修复汞污染提供了新的理论依据和微生物资源。

　　

汞，作为一种全球性污染物，其气态单质形式(Hg⁰)因其高挥发性、化学稳定性以及在环境中的强迁移能力，对生态系统安全构成严重威胁。随着工业化进程的加速，大量人为源Hg⁰被排放到大气中，其中燃煤电厂被认为是主要的Hg⁰人为排放源。在汞的生物地球化学循环中，植物叶片被广泛认为是吸收和固定大气Hg⁰的关键界面，是Hg⁰的重要“汇”。因此，植物在修复Hg⁰污染环境方面的潜力日益受到关注。

然而，植物修复效率的提升很大程度上依赖于对植物与其相关微生物之间相互作用机制的深入理解。近年来，越来越多的研究聚焦于植物相关微生物，特别是植物内生菌，在污染物吸收、转化和解毒过程中的作用。内生菌，最早由de Bary于1866年定义，能够系统性定殖于植物组织内部，通过促进养分获取、产生植物激素（如吲哚-3-乙酸，IAA）和增强抗氧化防御等机制，增强宿主的生长和胁迫抗性。

大约90%的Hg⁰在植物叶片组织内被氧化成汞离子(Hg²⁺)，并固定于表皮细胞、气孔细胞壁和薄壁组织细胞核中。随后，一部分Hg⁰可通过维管系统转运至其他植物器官。在植物体内，Hg⁰经历复杂的氧化还原循环过程。最终，仅有少量Hg⁰通过叶片重新排放到大气中，而大部分Hg则通过凋落物和分解作用进入土壤系统。特别值得注意的是，有研究发现，在汞胁迫解除后，西班牙苔藓(Tillandsia usneoides)在随后一个月内并未释放出可检测量的Hg⁰。这种高效的固定依赖于关键的内部氧化还原机制：吸收的气态Hg⁰主要在叶细胞内被氧化成Hg²⁺，这一过程可能由酶活性（如过氧化氢酶）和活性氧物种介导，随后通过与细胞壁和细胞核等细胞区室中的硫醇类配体（如谷胱甘肽）络合而固定。

为了应对这种Hg²⁺胁迫，内生菌进化出了特定的解毒策略。在重金属污染环境下，植物内生菌表现出多样且复杂的汞抗性机制。其中最具代表性的是汞抗性操纵子(mer operon)系统。该系统由多个功能基因组成，其核心是merA编码的汞还原酶，该酶能将高毒性的Hg²⁺还原为挥发性的Hg⁰，从而实现细胞解毒。不仅是内生细菌，内生真菌也在汞转化中扮演关键角色。例如，从斯洛伐克Rudňany地区分离的黑曲霉(Aspergillus niger)和枝孢菌(Cladosporium)能在短时间内挥发高达80%的Hg²⁺，表明它们可能通过类似于mer系统的机制参与自然条件下的汞循环。更重要的是，内生菌可通过多种机制显著增强植物在汞胁迫下的生长和存活能力，包括促进养分吸收、合成植物激素（如IAA）以及诱导系统抗性等。综上所述，这些共生微生物不仅提高了植物对汞胁迫的耐受性，还可能增强植物吸收和转化Hg⁰的效率，为构建高效的植物-微生物联合修复系统提供了坚实的理论基础和技术支持。

显然，植物内生菌在缓解重金属胁迫，特别是汞污染方面展现出独特优势，它们通过直接或间接机制增强植物的抗性和修复能力。然而，现有研究主要集中在微生物对离子态Hg²⁺的转化，而对于它们在植物耐受和转化气态Hg⁰过程中的作用，尤其是其对整个内生微生物群落结构和功能的影响，仍缺乏系统性的认识。这一知识缺口限制了我们在修复大气Hg⁰污染方面利用植物-微生物组合的能力。

本研究利用大气Hg⁰生物指示植物西班牙苔藓(T. usneoides)，旨在：（1）通过16S rRNA和内部转录间隔区(ITS)基因扩增子测序，分析Hg⁰胁迫对内生细菌和真菌群落结构的影响；（2）分离和筛选具有高Hg⁰耐受性和转化能力的内生菌，并探索其汞解毒（如Hg²⁺还原/富集）和促进植物生长的潜在机制；（3）通过将目标内生菌接种到模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，验证其在减轻Hg⁰毒性和促进植物生长方面的功效。总体而言，本研究试图从“Hg⁰-植物-内生菌”三方相互作用的角度，阐明内生菌在汞生物地球化学循环中的生态功能，为开发高效的微生物强化植物修复技术提供理论基础和微生物资源。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，对西班牙苔藓进行Hg⁰暴露实验，并通过高通量测序（16S rRNA和ITS基因）分析内生微生物群落变化。其次，采用含Hg²⁺的培养基从暴露后的植物组织中分离、纯化并鉴定耐汞内生细菌和真菌。随后，通过扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱(EDS)分析菌株形态及表面汞富集情况。并通过测定菌株在不同Hg²⁺浓度下的生长曲线和转化率，评估其耐汞性和Hg²⁺转化能力。同时，利用特定培养基平板法评估菌株的植物促生特性（如溶磷、解钾、固氮、产铁载体）。最后，通过叶面喷洒菌悬液的方式，在Hg⁰暴露环境下接种拟南芥，评估其对植物生长指标（生物量、根长、叶长、根表面积等）、体内汞含量以及植物激素IAA水平的影响。

3.1. Hg⁰暴露下西班牙苔藓内生细菌和真菌的群落组成和多样性

经过14天的暴露，Hg⁰暴露组西班牙苔藓中的汞含量迅速增加至164,900 ± 28,900 μg kg^?1，极显著高于对照组。α多样性分析表明，Hg⁰暴露显著降低了内生细菌群落的Chao、Sobs和ACE指数，而对内生真菌群落的这些指数影响不显著。β多样性分析显示，Hg⁰显著改变了西班牙苔藓内生微生物的群落结构。在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)是内生细菌群落的主要组成部分，其中变形菌门在Hg⁰胁迫下相对丰度显著增加。内生真菌群落则以子囊菌门(Ascomycota)为主。在属水平上，Hg⁰胁迫下，假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)和Massilia等细菌属以及Acidiella等真菌属的相对丰度增加。功能预测分析进一步表明，Hg⁰暴露组中，与汞解毒和抗氧化防御相关的关键酶，如汞还原酶(MerA)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达量显著上调。

3.2. 西班牙苔藓可培养内生微生物的分离、鉴定和功能表征

研究人员从含高浓度Hg²⁺的培养基中分离出五株内生细菌（L3, L9, L19, L6, LE）和两株内生真菌（G1, G2）。经鉴定，它们分别属于葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和曲霉属(Aspergillus)。Hg²⁺耐受性实验显示，所有菌株均能在一定浓度的Hg²⁺下生长，但其生长受到浓度依赖性的抑制。扫描电镜和能谱分析表明，菌株L6、LE和G2在Hg²⁺胁迫下能保持细胞结构完整，并在表面出现絮状沉淀，G2菌丝表面能检测到汞的富集。Hg²⁺转化能力测定显示，五株内生细菌在较低Hg²⁺浓度下具有较高的转化率，但随着浓度升高而下降；内生真菌的转化能力总体低于细菌。植物促生特性评估发现，这些菌株具备固氮、产铁载体、解钾、溶磷等多种促生能力，其中真菌G2表现出最全面的促生特性。

3.3. 内生菌对Hg⁰暴露下拟南芥生长的影响

叶面接种实验表明，Hg⁰胁迫显著抑制了拟南芥的生长，导致生物量、叶长、根长等指标下降。接种内生菌株LE、L6和G2后，能极显著地缓解这种生长抑制，促进植物生物量、叶长和根长的恢复，并增加根表面积。汞含量分析显示，接种L6显著降低了拟南芥体内的汞积累，而LE和G2则促进了汞的积累。此外，Hg⁰胁迫显著降低了拟南芥体内的IAA含量，但接种LE、L6和G2均能显著恢复IAA水平，表明这些内生菌可通过调节植物激素水平来缓解汞胁迫。

本研究系统阐明了Hg⁰胁迫如何重塑西班牙苔藓的内生微生物群落，并筛选出具有高效汞耐受和转化能力的菌株。研究发现，Hg⁰暴露导致内生细菌多样性降低，但富集了如假单胞菌属、肠杆菌属和曲霉属等关键耐受类群，这些类群上调了MerA、GSTs、CAT和SOD等解毒酶的表达。分离出的可培养内生菌采用不同的汞解毒策略（如还原Hg²⁺为Hg⁰或吸附汞）来减轻汞毒性，并表现出多种植物促生特性。更重要的是，通过叶面接种筛选出的内生菌株，能够有效缓解Hg⁰对模式植物拟南芥的胁迫，促进其生长，并调节体内的汞积累和植物激素IAA水平。该研究不仅深化了对“Hg⁰-植物-内生菌”三者互作机制的理解，而且为开发基于微生物辅助的植物修复技术以应对大气汞污染提供了宝贵的微生物资源和可行的生物强化策略，具有重要的理论价值和潜在的应用前景。论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》。