通过乙基氯甲酸酯衍生化后，利用反相液相色谱-质谱联用技术对 saxitoxin 及其类似物进行解析

《Forensic Chemistry》：Analysis of saxitoxin and analogues by reverse-phase liquid chromatography coupled to mass spectrometry after derivatisation with ethyl chloroformate

河豚毒素（STX）的验证需要高选择性分析方法，本研究通过乙基氯甲酸酯衍生化降低STX极性，优化后方法可区分STX与非管制同系物如新河豚毒素（NEO）等，在饮用水、食品基质及OPCW生物毒素比对测试中实现40 ppb检测灵敏度，并验证其在复杂基质中的应用价值。

　　

Karina Vignati|George Kaklamanos|Adriaan Marais|Daniel Noort|Prabhakar Sripadi|Yue Wang|Nathan W. McGill

化学与技术中心，禁止化学武器组织（OPCW），Stoomweg 20，Nootdorp，荷兰

摘要

根据《化学武器公约》，沙西毒素（STX）属于第一类管制化学品，其检测需要针对不同样本类型的高选择性分析方法。在本研究中，沙西毒素通过与氯甲酸乙酯衍生化处理，生成了极性较低的衍生物，同时保留了其区别于非管制同系物的结构特征。在优化衍生化条件后，该方法被应用于与化学武器测试相关的样本分析，包括真实样本检测和化学法医鉴定。该方案利用反相液相色谱-质谱（LC-MS）技术，在含有新沙西毒素、脱氨甲酰沙西毒素和脱氨甲酰新沙西毒素等非管制同系物的情况下，能够快速且选择性地检测出水中和饮料中浓度低至40 ppb的沙西毒素。此外，还对禁止化学武器组织首次生物毒素能力测试的样本进行了衍生化处理和分析，成功识别了空白样本以及添加了沙西毒素的样本。最后，该方法还应用于受污染的牡蛎匀浆液，证明了其在食品基质中的适用性。该方案补充了现有的沙西毒素分析方法，能够快速生成多种类型样本中沙西毒素的验证数据。利用反相LC-MS技术区分沙西毒素与其非管制同系物的能力是本研究的一大优势。

引言

沙西毒素及其类似物（STXs）是一类麻痹性贝类毒素（PSTs），主要由真核甲藻和原核蓝细菌在有害藻类暴发期间产生[1]、[2]。这些毒素通过阻断神经元钠通道干扰细胞生物电信号传导[3]，摄入毫克级剂量可能对人类造成致命危害[4]。随着人口增长和气候变化对自然食物来源和水源的持续压力，监测海鲜和饮用水中的沙西毒素变得越来越重要。为减少麻痹性贝类中毒（PSP）的发生，各国正在努力改进监测手段。欧盟食品安全局已将采集的海鲜中沙西毒素的限值设定为800 μg/kg，并可能进一步降低这一限值以应对其对人类健康的威胁[6]。

沙西毒素的高毒性使其被用于化学武器研发。20世纪50至60年代，科学家从天然来源中分离出沙西毒素并将其二盐酸盐形式武器化[7]。除了天然来源外，沙西毒素也可通过化学合成方法制备。自20世纪70年代以来，已有高效但效率较低的合成途径被报道[8]。最近，一种结合合成化学和工程酶的技术实现了十克级沙西毒素前体的高效生产，并能以毫克级高产率释放出沙西毒素[9]。

鉴于其武器化历史，沙西毒素被列入1997年生效的《化学武器公约》（CWC）附录中的第一类管制清单[10]。与蓖麻毒素类似，沙西毒素也是唯一被列入清单的天然毒素，需接受验证程序[11]、[12]，与神经毒剂和水疱剂等合成管制化学品相同。为支持公约下的验证工作，禁止化学武器组织（OPCW）及其指定实验室（DLs）正在开发生物毒素能力测试（PT），以明确区分沙西毒素与其他密切相关的非管制毒素，无论其来源如何[13]。

沙西毒素家族包含50多种高度官能化和极性强的同系物，它们之间的差异主要体现在细微的结构修饰上[14]。例如，沙西毒素与新沙西毒素（NEO）仅相差一个氧原子（图1）。尽管现代质谱仪能够轻松分辨这种质量差异，但某些方法仍无法有效区分它们。目前广泛采用的柱前氧化液相色谱-荧光检测方法存在选择性问题，因为沙西毒素和新沙西毒素会产生相同的氧化产物[15]。虽然在公共卫生领域这种处理方式可行（通常以沙西毒素当量报告浓度[6]），但在化学武器验证场景中会导致沙西毒素的不确定性。这一问题可通过柱后氧化解决，例如通过保留时间差异来区分两者。事实上，柱后氧化液相色谱-荧光检测已被考虑作为人类消费样品的常规分析方法[16]、[17]，但该方法需要专门的样品处理和仪器设置[18]，限制了其在非常规实验室中对微量化学武器残留物的分析应用。

为克服这些挑战，人们不断开发沙西毒素的鉴定方法。亲水相互作用液相色谱（HILIC）能够分离沙西毒素[19]，尽管它们本身具有高极性。然而，沙西毒素的极性使得常规的反相色谱分析变得复杂，而反相色谱是大多数化学武器残留物分析实验室常用的LC-MS配置。一种可能的解决方案是通过化学衍生化降低沙西毒素的极性，从而增强其与反相色谱的相互作用，改善分离效果[20]。

目前，很少有研究采用这种方法对沙西毒素进行衍生化处理。有一项研究使用丹磺酰氯在亲核位点对沙西毒素进行衍生化[21]，另一项研究则通过二硝基苯肼与沙西毒素缩合24小时进行衍生化[22]。但由于后者需要长时间孵育，无法满足化学武器应急决策或OPCW现场检查的快速需求。尽管这两项研究均成功鉴定出沙西毒素衍生物，但未探讨其在食品和饮料基质中区分沙西毒素与其他相关化合物（如新沙西毒素、脱氨甲酰沙西毒素和脱氨甲酰新沙西毒素）的能力。

采用Schotten-Baumann型条件，使用氯甲酸烷基酯试剂对沙西毒素进行衍生化可解决这些问题[23]。由于沙西毒素及其同系物含有多个亲核官能团，用亲电性的氯甲酸烷基酯衍生化可生成在反相色谱中表现更好的衍生物。由于氯甲酸烷基酯比许多衍生化试剂更耐水，因此可以直接在水样（如食品和饮料）中进行衍生化[24]、[25]。所得衍生物的极性低于母体化合物，可提取到有机溶剂中，然后通过灵敏的LC-MS实验进行分析。

为此，我们开发了一种使用氯甲酸乙酯衍生化沙西毒素的新方法，并在有限的食品和饮料基质上进行了测试。该方法应用于添加了40 ppb沙西毒素及其三种同系物（新沙西毒素、脱氨甲酰沙西毒素和脱氨甲酰新沙西毒素）的样品中。反相LC-MS（HESI）分析显示，沙西毒素可轻松与其他同系物区分。此外，该方法还成功应用于含有沙西毒素及其他多种PSTs的牡蛎组织样本。最后，该方法用于OPCW首次生物毒素能力测试的盲样分析中，有效验证了沙西毒素的存在。

因此，本方案通过快速生成多种类型样本中沙西毒素的验证数据，补充了现有的分析方法，即使在存在密切相关的非管制毒素的情况下也能有效鉴定沙西毒素。

部分内容

化学品和标准溶液

沙西毒素、新沙西毒素、脱氨甲酰沙西毒素和脱氨甲酰新沙西毒素的标准品购自Cifga（西班牙卢戈）。相应储备溶液配制在3 mM盐酸（HCl）中，储存于4°C。HPLC级二氯甲烷（DCM）、乙腈（ACN）和水购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。烷基氯甲酸盐、37%浓度的盐酸及其他所有化学品均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），除非另有说明。使用ISOLUTE相色谱柱。

结果与讨论

本研究的目的是开发一种方法，用于区分《化学武器公约》第一类管制的沙西毒素及其未列入公约的类似物。这对于真实化学武器分析、OPCW现场检查和生物毒素能力测试尤为重要。根据要求，生物毒素能力测试需使用两种独立分析方法确认沙西毒素的存在，其中至少一种方法应为数据丰富的分析技术（如质谱法[27]。

结论

需要改进沙西毒素的分析方法，尤其是针对化学武器残留物检测场景的相关样本类型。本研究探讨了在水性碱性条件下使用氯甲酸乙酯对沙西毒素进行衍生化的方法，以提高其鉴定效率。衍生化反应生成了极性较低的新的化合物，这些化合物可通过反相液相色谱轻松检测。

该方法已针对沙西毒素进行了优化。

CRediT作者贡献声明

Karina Vignati：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、监督、方法学设计、概念构建。George Kaklamanos：撰写——审阅与编辑、验证、方法学设计、实验设计。Adriaan Marais：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、概念构建。Daniel Noort：撰写——审阅与编辑、监督、方法学设计、概念构建。Prabhakar Sripadi：撰写——审阅与编辑。Yue Wang：撰写——审阅与编辑。

资金来源

本研究得到了英国及北爱尔兰国防部的自愿资助。

未引用参考文献

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利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。