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这篇综述系统阐述了CRISPR-on-Chip技术如何将CRISPR-Cas系统的高特异性、灵敏度与微流控（Microfluidics）技术的微型化、自动化优势相结合，为即时诊断（Point-of-Care, PoC）带来突破。文章详细分析了基于核酸（如Cas12、Cas13）与非核酸靶标（如蛋白质、金属离子）的检测模态，深入探讨了聚合物基、纸基、数字、离心式等多种微流控芯片平台（如CARMEN、PLACID）的集成策略、性能指标及其在传染病检测、癌症生物标志物分析、个性化医疗等领域的应用潜力，同时指出了当前技术在全自动化集成、多重检测、临床应用转化等方面的挑战，并对人工智能（AI）、深度学习（DL）赋能下的未来发展方向进行了展望。
CRISPR-Cas系统：从基因编辑工具到诊断利器
CRISPR-Cas系统最初是原核生物抵御噬菌体感染的适应性免疫机制。经过工程化改造，特别是CRISPR-Cas9的出现，使其成为强大的基因编辑工具。在诊断领域，CRISPR-Cas系统（如Cas9, Cas12, Cas13）因其高特异性和灵敏度而受到青睐。Cas12和Cas13酶在识别特定DNA或RNA靶标后，会表现出“旁路切割”活性，能够非特异性切割周围的报告分子（如荧光标记的ssDNA或ssRNA），从而产生可检测的信号。尽管存在脱靶效应、样品制备污染风险以及定量能力有限等挑战，但通过信号放大策略（如结合RPA、LAMP等等温扩增技术）和多种检测方法（荧光、侧向层析、电化学传感），CRISPR-Dx（CRISPR诊断）平台已展现出巨大潜力。
CRISPR-Cas诊断模式：核酸与非核酸靶标并进
CRISPR诊断平台主要分为基于核酸和非基于核酸的两大类。
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核酸检测平台：可分为预扩增和无扩增两种策略。预扩增平台常将CRISPR检测与聚合酶链式反应（PCR）或等温扩增技术（如RPA、LAMP、NASBA）结合，实现极高的灵敏度（可达aM级别），但可能存在污染风险和处理时间较长的问题。“一锅法”平台将扩增与CRISPR反应整合在一个反应管内，简化了操作流程。无扩增平台则致力于避免扩增步骤，直接检测目标核酸，虽简化流程，但通常灵敏度要求较高浓度的靶标，通过多重crRNA、信号级联放大等技术提升性能。
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非核酸检测平台：CRISPR技术也被创新性地用于检测蛋白质、小分子、金属离子等非核酸靶标。例如，CRUISE技术将CRISPR-Cas12a与免疫分析结合，通过抗体偶联的ssDNA激活Cas12a的旁路切割，实现了对蛋白质标志物的超灵敏检测，灵敏度比传统ELISA提升千倍。
CRISPR与微流控的联姻：下一代诊断平台
微流控技术通过将样品制备、核酸提取、反应和检测等步骤集成到微型芯片上，为CRISPR诊断提供了自动化、微型化和高通量的解决方案。CRISPR-on-Chip技术将两者的优势结合，旨在开发便携、快速、高灵敏的即时诊断设备。
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样品制备策略：有效的样品预处理和核酸提取是芯片成功的关键，方法包括磁珠提取、过滤、等速电泳等，旨在实现芯片上的全集成。
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微流控CRISPR-Dx平台：
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聚合物基芯片：采用PDMS、PMMA等材料，通过热压、3D打印等技术制造。例如，一种PDMS/玻璃芯片实现了对多种肠道病原体的一锅法RPA-CRISPR/Cas12a检测，具有高程序化能力。IMPACT系统利用PDMS微柱结构固定ssDNA探针，通过Cas12a活性进行荧光检测。CASCADE系统则通过Cas12a激活催化酶产生气泡，用手机摄像头读取信号，实现无扩增检测。
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纸基芯片：成本低、易制造、环保。例如，基于CRISPR-Cas12a和葡萄糖氧化酶的纸基生物传感器，可通过智能手机进行电化学和比色双模式检测miRNA-141。PLACID平台将LAMP与CRISPR-Cas12a集成在纸基芯片上，通过智能手机应用进行荧光读取，适用于现场检测。
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数字微流控芯片：通过将反应体系分割成大量纳升级液滴或微腔，实现单分子水平的超灵敏定量检测。例如，基于液滴的平台可对16S rRNA、microRNA、SARS-CoV-2等进行单分子检测。CARMEN及其升级版mCARMEN平台利用液滴编码技术，实现了对上百种病毒的高通量多重检测。
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离心式微流控芯片：利用离心力驱动流体，易于实现自动化和集成。例如，Cas12-MRVDB盘片可同时检测14种呼吸道病毒RNA。CASMEAN系统在离心微流控盘上自动完成RAA和CRISPR-Cas12a反应。AMIC平台整合了核酸提取、RAA扩增和CRISPR-Cas13a检测，实现了全自动分析。
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AI与深度学习集成平台：结合智能手机和AI算法，提升结果分析的准确性和自动化程度。例如，基于深度学习算法的微孔阵列芯片可实现Cryptococcus真菌的高灵敏度检测和精准计数。一些平台利用AI进行荧光图像分析，实现HIV RNA等的精确定量。
CRISPR-on-Chip在个性化医疗中的应用前景
该技术在个性化医疗中展现出巨大潜力，可用于快速鉴定遗传突变（如杜氏肌营养不良、镰状细胞病相关变异）、癌症驱动基因（如EGFR 19缺失突变、TP53热点突变）以及微小残留病灶（MRD）监测。结合微流体器官芯片模型，还能实现患者特异性的药物筛选和实时疗效评估。
当前局限与未来展望
尽管CRISPR-on-Chip技术取得了显著进展，但仍面临一些挑战：全自动化“样本入-结果出”平台的集成度仍需提高；无预扩增检测的灵敏度极限有待突破；多重检测能力的扩展和标准化；试剂稳定性（如冷链需求）对资源有限地区应用的制约；以及临床验证和规模化生产的挑战。未来发展方向包括：开发更高效的样品处理和新颖信号放大策略（如纳米材料）；利用AI/深度学习优化gRNA设计、预测脱靶效应、自动化微流控设计及结果解读；加强与物联网（IoT）、云平台的集成，实现实时数据分析和远程医疗监控。通过学术界、产业界和监管机构的协同努力，CRISPR-on-Chip技术有望成为变革传统分子诊断、推动精准医疗和全球公共卫生防控的强大工具。
结论
CRISPR-on-Chip技术通过融合CRISPR-Cas系统的编程特异性与微流控的微型化自动化优势，为开发下一代即时诊断工具开辟了道路。其在传染病快速筛查、癌症早诊、个性化用药指导等方面具有广阔应用前景。随着技术瓶颈的逐步突破以及与AI等前沿技术的深度融合，CRISPR-on-Chip有望在未来诊断领域扮演越来越重要的角色。
