《Environmental Science & Technology》：Hierarchical Mechanistic Modeling of Complex Toxicity Endpoints from Public Concentration–Response Data
引言
新兴环境污染物，包括工业化学品、药品、个人护理产品和农药，通过环境持久性、生物累积潜力和诱导不良生物效应的可能性，对人类和生态健康构成重大风险。2019年，有害化学物质暴露估计导致约200万人死亡（占全球总死亡率的3.6%）和5300万伤残调整寿命年（DALYs），构成了显著的公共卫生负担。这些化学物质可在人体组织中积累，导致短期暴露后的急性毒性以及发育和肝损伤等慢性健康结局。例如，内分泌干扰化学物质调节激素调控的信号通路（如甲状腺、雌激素和雄激素受体），引发生殖、发育和代谢紊乱。尽管人类普遍暴露于数千种合成和天然存在的化学物质，但许多化学物质的毒理学特征仍未明确，这使监管评估和化学安全性评估复杂化。
传统上，体内毒性测试指导化学物质风险评估。常见的终点指标包括半数致死剂量（LD50），它估计在50%的测试群体中引起死亡的剂量，源自急性全身毒性测试。类似地，未观察到不良反应水平（NOAEL）确定了在重复剂量研究中未观察到治疗相关不良效应的最高剂量。尽管这些方法是毒理学评估的基础，但它们通常资源密集、耗时、成本高，且对于评估大量未经测试的化学物质不切实际。这些局限性促使联邦政府持续支持新方法（NAMs），以及近期美国食品药品监督管理局（FDA）、环境保护署（EPA）和国家卫生研究院（NIH）的监管沟通，以加速采用非动物、与人类相关的模型。此类NAMs包括高通量筛选（HTS）、计算机建模方法和如不良结局通路（AOP）的机制框架，所有这些都可以更有效地支持化学风险评估。
大规模筛选计划，如EPA的毒性预测器（ToxCast）和21世纪毒理学（Tox21）项目，已生成了与化学毒性相关的大量HTS数据。这些与FDA、国家转化科学促进中心（NCATS）和国家毒理学计划（NTP）合作进行的项目，产生了广泛的公开HTS数据集，适用于系统性毒性评估和化学物质优先级排序。HTS方法可以快速测试数千至数百万种化学物质针对不同的分子靶点和信号通路，为整合到AOP框架内提供补充的机制数据。经经济合作与发展组织（OECD）认可，AOP框架描述了毒性从分子起始事件（MIEs）（其中应激源直接与分子靶点相互作用触发生物响应通路）通过关键事件（KEs）到不良结局（AOs）（如化学诱导的肝毒性）的生物学进程。然而，由于生物系统的复杂性和对上下游信号级联的有限理解，将HTS衍生数据转化为可靠的体内毒性预测仍然具有挑战性。
计算建模方法试图将大规模HTS数据整合到预测毒理学框架中，以克服当前大数据时代AOP的局限性。传统建模方法，如定量结构-活性关系（QSARs），基于化学结构和物理化学性质预测毒性。然而，这些模型通常受限于狭窄的化学空间覆盖、稀疏的训练数据以及容纳异质大规模数据集的受限能力。机器学习方法的进展通过纳入浓度响应数据和暴露相关指标，改进了基于HTS的预测毒性建模。先前的监督学习方法识别了毒性生物标志物，混合QSAR模型增强了对数据有限终点的预测准确性。尽管如此，协调和从HTS数据中提取机制信息仍然是一个核心挑战，需要新的建模策略来处理、整理和构建浓度响应数据为有生物学意义的毒性机制。
分层建模为将异质数据组织成多级生物学表征以进行毒性建模提供了稳健策略。先前构建分层模型的努力包括用于急性毒性预测的双层QSAR模型和使用多维数据集对细胞色素P450（CYP）相互作用进行分类。分层深度学习的最新进展通过嵌入通路知情的表示（例如使用迁移学习和无监督学习）扩展了这些应用，以处理不完整或不一致的输入并生成可解释的输出。结构化建模方法，如PROGENy，通过基于矩阵的变换将高维转录组数据投射到通路水平活性上，增强了机制分辨率。然而，大多数现有建模研究依赖单一来源的数据集，并未充分利用来自不同资源和平台的浓度响应HTS数据。解决这一差距需要能够协调和整合异质数据集并提取机制信息以提高模型准确性和生物学可解释性的建模方法。
本研究提出了一个分层计算建模框架，整合浓度响应HTS数据、整理的生物学通路信息和基于机器学习的建模，以预测跨多个终点的化学毒性。具体而言，该框架（1）将浓度响应HTS数据映射到分子靶点以量化蛋白质相互作用（蛋白质评分）；（2）将蛋白质评分聚合以表征通路水平扰动（通路评分），总结了每个通路在化学暴露下的整合生物响应；（3）将通路评分与毒性结局关联，纳入体内暴露估计以 refine 预测准确性。该方法通过提高模型性能和增强机制可解释性，解决了与数据稀疏性、异质性和生物复杂性相关的挑战。将浓度响应数据与分层通路建模相结合，为预测毒理学提供了一个可扩展和可解释的策略，并支持化学风险评估NAMs的开发。
方法
体内毒性数据收集
本研究的体内毒性数据集从先前的内部建模研究和公开文献来源编译而成。该数据集包括急性口服全身毒性（LD50）、母体和产前发育毒性（NOAEL）以及人类和临床前肝毒性的二元分类。这五个毒性终点是从先前整理的数据集中选出的，以保持方法连续性并支持比较和机制评估。使用国际化学标识符（InChI）标准化化学结构以实现跨来源一致性。整理后，用于模型训练的最终体内毒性数据集包含10,781种独特化学物质。
急性全身毒性数据从口服啮齿动物研究收集，并从多个数据库汇总，涵盖8699种独特化学物质。对于具有多个LD50记录的化合物，保留最低剂量以保守估计毒性。
母体和产前发育毒性数据源自口服啮齿动物研究，包括446种具有发育毒性结果的独特化合物和375种具有母体NOAEL数据的独特化合物。所有评估母体毒性的375种化合物也存在于发育数据集中。评估的结局包括畸形、胚胎致死性、生长迟缓和宫内功能损伤。
肝毒性数据来自Mulliner等人，包括来自临床前动物研究的实验性体内结局和人类临床观察。完整的肝毒性数据集包含3250种具有临床前结局的独特化合物和2171种用于人类肝毒性记录的独特化合物，其中1709种化合物在两个集合中重叠。人类数据源自临床试验、上市后不良事件报告和整理的文献来源。临床前子集包括制药和工业化合物，尽管一些缺乏详细的动物毒性文档。
急性、母体和发育毒性被建模为连续终点以量化化合物间毒性效力的变化。相比之下，肝毒性根据报告的不良肝脏结局被视为二元分类，反映了可用体内数据的分类性质，并在同一建模框架内支持毒物分类。
HTS数据预处理和标准化
HTS数据从PubChem获得，并使用WikiPathways中预定义的基因-通路关联映射到人类特异性通路。WikiPathways提供了一个开放的、社区整理的人类通路集合，具有标准化的通路表示和程序接口，使基因水平HTS数据能够在本研究范围内定量整合。对测定进行整理，仅保留具有有效标识符和可用浓度响应数据的测定，这些数据通过Hill方程参数化。
对于每个化合物-测定对，提取Hill模型参数：AC50（半最大效应浓度）、Hill斜率（曲线陡度）和Top（最大模型响应）。Hill模型定义了浓度C处的拟合浓度响应R(C)。为了表征化合物诱导的响应行为，提取Top参数作为总结统计量，代表Hill模型在高浓度下预测的渐近响应水平。正Top值表示激活，负值表示抑制。对于每个测定，计算测试化合物中观察到的minTop和maxTop。根据模型Top值的方向和范围，将测定分为三类，反映不同的潜在作用机制：阳性、阴性和混合。不符合这些标准的测定被排除。
所有化合物-测定对的浓度响应数据在1 pM至100 μM的45个对数间隔浓度的标准化网格上进行评估，以确保所有测定的统一输入维度。使用拟合的Hill方程参数在这些浓度计算每个对的响应值。模型响应通过将拟合基线重新缩放为0%，化合物特异性Top值重新缩放为100%进行归一化，产生从0到100%的有界活性尺度。当同一化学测定对的多个浓度响应数据集可用时，读数首先归一化到对数浓度范围。然后将响应缩放到0%到100%的标准化区间。应用重叠浓度范围插值和质量控制过滤器，仅保留最可重复的谱。协调的数据集被组装成一个三维张量，称为Assay，并用作后续蛋白质评分建模的输入。
分层建模、统计过滤和模型训练
实施分层建模框架，使用归一化HTS浓度响应数据表示化学诱导的生物活性并预测毒性评分。模型架构包括三个顺序层，每层由矩阵操作表示：M1（测定到蛋白质）、M2（蛋白质到通路）和M3（通路到毒性）。每层使用矩阵乘法（张量收缩）和基于梯度的优化实现。
输入张量Assay具有维度，其中每个元素代表给定化合物-测定对的归一化Hill拟合响应。在第一个变换中，引入潜在蛋白质张量Prot作为可训练参数，并通过可学习矩阵M1从Prot重建Assay。在第二层中，使用可学习矩阵M2从Prot重建通路活性（Path）。得到的Path张量在通路水平编码模型化的生物活性。该层能够将活性解释为协调的通路扰动，从而提高了与孤立蛋白质响应相比的机制分辨率。通过反向传播最小化重建和观察输入张量之间的均方误差（MSE）来学习矩阵M1和M2。使用Adam优化器和ReduceLROnPlateau学习率调度器进行训练，最多进行1000个周期，并在收敛时实施早期停止。
最终变换引入可训练的毒性张量（Tox）。将监督过滤矩阵M3应用于Tox以重建模型化的通路评分（Path）。Tox被优化，使得变换产物近似模型化的Path张量。与M1和M2不同，M3使用监督统计过滤导出，以保留生物学上合理且统计显著的通路-终点关联。
对于连续毒性终点，计算Path评分与观察到的毒性终点值之间的Pearson相关系数。仅当通路-终点对满足所有以下标准时才保留在M3中。选择r ≥ 0.1的截止值以捕获中等但具有生物学意义的关联，而FDR校正控制了多重检验。跨相关性阈值的敏感性分析产生了可比较的通路-终点关联集，表明模型结果对合理阈值变化是稳健的。应用Fisher z变换估计r的95%置信区间（CIs）。
对于二元终点，执行毒性和非毒性组之间Path评分分布的非参数比较。使用Wilcoxon秩和检验；否则应用Brunner-Munzel检验。效应大小表示为等级双列相关性（rrb），使用Fisher z变换估计95% CI。如果rrb> 0且FDR调整q值 < 0.05，则保留二元通路-终点对在M3中。
过滤后，M3被二值化以定义最终监督变换结构。通过最小化重建Path评分与上游模型化Path张量之间的MSE来重新优化得到的Tox张量。该层遵循与早期层相同的训练协议。M3的监督训练依赖于过滤过程，将此层与无监督层区分开来。训练后，使用最小-最大缩放将每个终点组内的Tox评分归一化到[0, 1]以进行跨化学物质可比性。
所有映射使用未加权的MSE。为了减轻具有较大样本量的终点的不成比例影响，通路到毒性映射被限制为满足显著性阈值和最小相关性阈值的通路-终点对。训练后，每个终点内的毒性评分被归一化。每个终点的样本量与结果一起报告，以支持模型性能的解释。
毒代动力学建模用于暴露整合
为了在真实暴露条件下检查毒性预测，采用毒代动力学（TK）建模来估计一部分化合物的稳态血浆浓度（Css）。使用EPA的httk包计算Css值，该包实施基于生理的药代动力学建模以模拟指定外部剂量场景下的内部血浆浓度。估计值是在标准化重复剂量口服暴露1 mg/kg/day的假设下生成的。
Css值可用于567种具有相应HTS测定数据和httk包中提供TK参数的化合物。仅用于曲线归一化或模型校准的化合物被排除。Css值是独立计算的，并且仅在事后评估中应用于标准化1 mg/kg/day口服给药场景，以确保跨化合物可比性。这些暴露整合结果受到毒代动力学数据覆盖范围的可用性和给药场景中固有假设的限制。尽管这种标准化方法能够进行一致的评估，但建模框架保持灵活，并且可以在未来的应用中纳入化合物特异性或基于人群的暴露估计。
为了表示清除和代谢的个体间变异性，Css被建模为群体分布。第5百分位数代表具有较高代谢能力和清除率的个体，而第95百分位数代表清除较慢的个体，近似敏感亚群中的潜在响应。每个化合物的第95百分位数Css用于案例研究评估，以比较模型化的暴露估计值与Assay、Prot和Path水平的预测生物活性。这些比较评估了模型化的效应是否在与内部人类暴露相关的浓度下发生，从而支持NAM框架内的危害解释。
结果与讨论
用于预测化学毒性的分层建模工作流
分层建模方法通过整合来自PubChem的浓度响应HTS测定和来自WikiPathways的过滤生物学通路定义进行毒性预测。此工作流将体外生物活性转化为多个机制水平的结构化生物学评分，为复杂终点生成可解释的毒性预测。
首先，来自HTS测定的归一化浓度响应谱被编译成三维Assay张量，代表跨测定和浓度的化合物响应。这些数据作为模型第一层的输入，其中HTS测定响应使用矩阵M1映射到Prot评分。得到的Prot张量编码模型化的化学-蛋白质相互作用，对应于MIEs和KEs。
其次，Prot评分通过矩阵M2变换聚合成Path评分。此步骤在通路水平总结了生物活性，反映了机制相关蛋白质的扰动。Path张量随后用于通过矩阵M3生成Tox评分，该矩阵是使用通路-终点关系的监督学习过程构建的。得到的Tox评分代表跨五个终点的模型化AOs：急性全身毒性、母体和发育毒性以及人类和临床前肝毒性。
第三，使用TK建模估计具有可用参数的化学物质的Css值。这些估计值被应用于识别那些模型化体内暴露可能达到或超过跨Assay、Prot和Path水平预测效应浓度的化合物。Css被事后纳入以评估模型化预测的暴露相关性。
最后，分析分层模型的输出以识别有助于预测毒性的生物学特征。检查测定水平响应以及Prot评分和Path评分，以识别最终Tox评分的关键生物学驱动因素。这些分析支持化学效应的机制解释，并实现下游应用，如化合物分组、通路知情的危害评估以及模型透明度和监管决策支持的数据结构化。
测定选择和蛋白质映射
从最初映射到WikiPathways基因的297,803个PubChem测定中，总共识别出1247个测定，这些测定包含有效的浓度响应数据并且可以使用Hill方程参数化。这些测定对应于371个独特基因，这些基因被保留以整合到建模框架中。为每个化合物-测定对提取Hill模型参数，并且测定水平响应由Top参数表征，该参数估计在高浓度下实现的最大响应。
为了实现测定和化合物之间的可比性，使用测定特异性minTop和maxTop值归一化浓度响应曲线。这些值定义了在每个测定中所有测试化合物观察到的拟合响应曲线的下限和上限平台。使用这些边界进行归一化展示了功能活性的整体范围，保留了测定机制的生物学相关性，最小化了来自非活性化合物的噪声，并实现了跨测定的标准化化合物活性比较。
在整理的1247个测定中，641个表现出正的minTop和maxTop值，指示激动剂样行为，其中大多数化合物在可测量激活测定靶点后诱导向上信号偏移。具有正Top测定的一个例子是用于小分子雄激素受体信号激动剂的定量HTS测定。相比之下，304个测定显示负minTop但正maxTop值，指示跨测试化合物的混合机制。具有这种混合响应谱的一个示例测定是用于小分子抗氧化反应元件信号通路激动剂的qHTS测定。剩余的302个测定表现出负minTop和负maxTop值，模拟测试化合物的拮抗剂样行为。这组的一个代表性测定是用于小分子雄激素受体信号拮抗剂的qHTS测定。
根据定义，Hill模型约束最大值超过最小值；因此，右下象限中的测定在理论上无效。这种基于象限的分类通过化合物响应的方向性揭示了测定分组，尽管跨个体浓度响应谱存在曲线形状、噪声或分辨率的变异性。
出于建模目的，初始测定数据集被过滤以仅包括具有有效Hill模型参数的测定以及存在于毒性数据集中并表现出可测量活性适合模型训练的化合物-测定对。在识别出的具有浓度响应数据的1247个测定中，并非所有测定都具有足够的参数化用于建模，由于缺失或无效的Hill拟合。过滤后，455个测定满足纳入标准并被保留用于整合到蛋白质层建模步骤中。
在保留的测定中，大多数在每个化合物测试五个或更多独特浓度，整个数据集中每个化合物平均11个浓度。每个化合物测试的浓度数量范围从两个浓度，如在靶向细胞外信号调节激酶信号通路抑制剂的qHTS测定中观察到的，到46个浓度，如在用于小分子p53信号通路激动剂的qHTS测定中报告的。
过滤的测定集使用PubChem中提供的测定-蛋白质关系映射到216个独特蛋白质靶点。蛋白质靶点及其映射测定的完整列表在补充表1中提供，具有五个或更多测定的蛋白质子集如表1所示。平均每个蛋白质与两个测定相关联。此映射过程用于计算Prot评分，使用相应的测定水平响应量化化合物特异性与216个蛋白质靶点的相互作用。
化学-蛋白质响应分析
核因子红细胞2样2是响应氧化应激调节抗氧化和细胞保护基因表达的转录因子。该蛋白质靶点映射到11个在过滤有效浓度响应数据后保留的HTS测定。使用矩阵M1为470种化合物计算了Nrf2的Prot评分，该矩阵将测定水平响应映射到蛋白质水平活性。Nrf2的Prot评分范围从-1.5到1，代表从整合HTS响应导出的模型化化合物特异性Nrf2活性调节。
得到的Prot值区分了两类模型化的作用机制：Nrf2信号的抑制和激活。这种区分平行于在ARE信号测定中观察到的双向活性趋势，负和正拟合响应对应于调节此应激响应通路的化合物。具有负Nrf2 Prot评分的化合物，包括糖皮质激素类似物，共享类固醇样结构特征，并与Nrf2信号抑制相关。糖皮质激素减少氧化应激和促炎信号，从而减少对Nrf2介导的抗氧化响应的细胞需求。相反，具有正Prot评分的化合物被模型化为激活Nrf2。两个例子含有苯甲酰胺支架内的亲电子取代基，可能促进Nrf2从其负调节因子Keap1解离，允许Nrf2易位到细胞核，然后激活抗氧化基因的转录。研究结果表明，从测定水平响应导出的Prot评分可以推断化合物水平Nrf2调节的方向性，并识别与已知作用机制的结构-活性关系。
化学聚类和毒性谱
为了检查化学结构、蛋白质水平活性和体内毒性结局之间的结构-活性关系，使用MACCS指纹和Taylor-Butina算法以0.7的Tanimoto相似性阈值对化合物进行聚类，通过共享子结构相似性分组化合物。排除少于五个化合物的簇，导致33个簇保留用于分析。每个簇的最大共享子结构被编码为SMARTS模式。连续毒性终点使用负以10为底的对数进行对数变换。通过将每个簇的中位毒性值针对该终点所有化合物水平值的平均值和标准差标准化来计算簇水平z分数。对于二元终点，二元值被分类为0或1，转换为z分数，并乘以-1以保持与连续毒性终点值的方向一致性。在此尺度上，较高的z分数指示所有终点的毒性增加。使用体内毒性z分数和模型化Prot评分比较簇毒性谱。
跨簇观察到独特的毒性谱。由吩噻嗪组成的簇130与人类肝毒性相关，但急性全身毒性低。吩噻嗪是具有已知肝毒性风险的神经松弛剂，通常归因于CYP介导的代谢激活和反应性中间体的形成，这些中间体有助于药物性肝损伤。大多数簇130化合物对CYP3A4、CYP2D6和CYP2C19具有负Prot评分，指示可能损害代谢清除并增加肝应激的抑制活性。这些肝毒性化合物也对SARS-CoV-2表面糖蛋白显示负Prot评分，这是模型中包含的病毒靶点。一个例外，显示正CYP3A4 Prot评分，并且先前被分类为最高DILI关注水平。尽管将pecazine与CYP介导的肝毒性直接联系的证据仍然有限，但观察到的相互作用可能暗示尚未被当前谱完全阐明的肝损伤替代机制。
簇6在所有簇中发育毒性排名最高，指示在相对低暴露水平下的不良效应。在21种化合物中，11种显示负CYP1A2 Prot评分，14种化合物显示负CYP2C19 Prot评分，排除非活性评分。这些数据提示与这些CYP酶的有限模型化相互作用，暗示通过CYP1A2或CYP19的代谢激活不是此簇中观察到的毒性所必需的。相比之下，急性全身毒性最小，具有高LD50值，指示这些化合物在急性暴露条件下通常不具毒性。低发育NOAEL和低急性毒性的组合支持了一种机制，涉及在亚致死剂量下的通路特异性和直接发育破坏，而不是广义的急性全身毒性。
主要由有机磷化合物组成的簇98在所有簇中表现出最高的急性全身毒性，中位LD50为10 mg/kg。这些化合物广泛用作农药，并共享一个完善的急性毒性作用机制，涉及乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制，导致胆碱能危机和呼吸衰竭。模型化的蛋白质水平相互作用显示适度的CYP3A4抑制，指示次要代谢参与，但在AChE驱动机制中不是主要作用。
完全由磺胺类组成的簇207在所有簇中表现出最高的肝毒性。磺胺诱导的肝损伤通常是特异质性DILI，机制归因于代谢生物激活和免疫介导的响应。几种簇207化合物对CYP酶显示负Prot评分，包括CYP3A4、CYP2C9和CYP2D6。这些模型化CYP酶活性的降低可能损害解毒并促进代谢物积累。总之，这些结果突出了将结构聚类与蛋白质水平活性建模相结合如何描绘具有与毒性结局机制关联的化学组。
通路映射和与毒性结局相关通路的识别
来自分层模型的总共216个蛋白质被映射到从WikiPathways获得的550条生物学通路。对于每种化合物，使用矩阵变换M2计算Path评分，跨测试浓度范围将Prot评分聚合成通路水平扰动谱。因为并非所有550条通路都预期有助于毒性结局，所以应用统计过滤以识别生物学和统计学上相关的关联。如果它们的Path评分显示与毒性结局统计显著且正相关，则保留通路。此监督特征选择过程确保只有具有增加毒性潜力的通路被纳入下游监督建模阶段。通过此过滤过程，识别出103条独特通路与至少一个毒性终点统计相关：24条通路与急性全身毒性相关，24条与母体毒性相关，31条与发育毒性相关，7条与人类肝毒性相关，41条与临床前肝毒性相关。与多于一个毒性终点相关的20条通路之间的重叠揭示了不同毒性结局背后共享的生物学机制。
表2列出了每个终点的前五个显著通路，按相关性强度排名。通路扰动和毒性结局之间的统计关系在补充图1中说明。对于连续终点，Path评分和对数变换毒性值之间的线性回归分析证明了正相关性。对于二元肝毒性，箱线图比较了肝毒性和非肝毒性化合物之间的Path评分分布，具有相应的相关性统计。这些分析确认选定的通路扰动与毒性终点统计相关，并反映了由先前文献支持的合理机制。
除了确认已知通路外，此框架可以识别在公共数据库如WikiPathways中缺乏机制表征的表征不足或数据稀疏的通路。示例包括Alstr?m综合征、2q13拷贝数变异综合征、门静脉窦血管疾病、血管生成素样蛋白8调节、UDP衍生糖合成、犬尿氨酸和细胞衰老以及netrin-UNC5B信号传导。识别这些通路证明了框架优先处理机制不确定领域以进行靶向实验调查并支持NAMs改进的能力。此外，通过识别新的测定-通路关系，该框架可以为毒性机制信息有限的化学类别的新的测试策略的开发提供信息，有助于公共资源中通路定义的持续扩展和整理。
毒性评分
通过学习的M3矩阵变换Path评分来计算每种化合物的Tox评分。使用103条统计过滤的通路作为输入特征，为五种毒性终点计算了3769种化合物的评分。在模型实施期间，每条通路同等贡献。
归一化Tox评分用于对每个终点的化合物进行排名，并相应地识别得分最高的化合物。例如，西沙必利具有归一化平均Tox评分0.54。对每个相应终点达到最大归一化Tox评分1的化合物包括用于急性全身毒性的氯硝柳胺、用于母体毒性的艾利泊地、用于发育毒性的毛喉素、用于人类肝毒性的NS-398和用于临床前肝毒性的丙环唑。这些化合物由于扰动对复合Tox评分贡献最大的关键通路而被预测为高毒性。
在这些化合物中，氯硝柳胺是一种批准用于绦虫感染的口服驱虫药，根据欧盟分类、标签和包装法规被分类为H302和H400。艾利泊地是一种非竞争性NMDA受体拮抗剂，在急性缺血性中风的临床试验中进行了研究，但由于疗效不足而中止。关于艾利泊地的直接母体毒性数据未被识别；然而，氯胺酮在母体暴露后在发育中的大鼠脑中诱导广泛的神经凋亡，提示此结构类别的潜在产前神经发育风险。毛喉素直接激活腺苷酸环化酶，据报道会破坏鸡胚胎的心血管发育，尽管详细的机制研究仍然有限。NS-398是一种选择性COX-2抑制剂，在结构上与尼美舒利相关，属于一类与人类特异质性肝毒性相关的化合物。尽管其确切机制不清楚，但肝毒性怀疑涉及反应性代谢物的形成。丙环唑是一种三唑类杀菌剂，人类数据有限，在小鼠研究中诱导肝毒性和肝肿瘤，男性报告发病率较高。
基于四分位数的毒性潜力分类
通过将化合物基于每个终点的归一化Tox评分分层到四分位数中来评估模型可解释性。较高的四分位数代表具有较高预测值的化合物。通过评估较高四分位数内统计显著通路扰动的富集及其与每个毒性终点相关的已知机制通路的一致性来量化生物学可解释性。大多数化合物表现出低至中等Tox评分；Q4中的化合物显示出显著更高的评分和在与AOs统计连接的通路中更大的预测活性。这种基于四分位数的分类评分结构能够跨化学物质进行预测毒性的比较评估，并支持潜在的监管应用。例如，使用联合国全球化学品统一分类和标签
