《Frontiers in Ecology and Evolution》：Aspects of the blood meal of mosquitoes (Diptera: culicidae) during the crepuscular period in Atlantic Forest remnants of the state of Rio de Janeiro, Brazil
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本研究通过分子生物学技术（Sanger测序）分析巴西大西洋森林保护区（REGUA和Sítio Recanto Preservar）蚊虫的吸血来源，揭示了其以人类为主的取食倾向，强调了环境变化（如森林砍伐）对蚊媒行为及虫媒病毒（如登革热、寨卡、基孔肯雅热）传播风险的影响，为优化蚊媒控制策略提供了关键生态学依据。
引言
识别蚊虫的食物来源是研究其觅食行为、生活史及宿主选择偏好的关键，这对于理解蚊媒在病原体维持和传播中的作用至关重要。在生物多样性极其丰富且复杂的大西洋森林生态系统中，此类研究显得尤为重要。人类活动导致大西洋森林原始覆盖面积大幅减少，仅存约29%，这种生境破碎化可能改变蚊媒的分布及其宿主寻找行为，进而影响虫媒病毒（如登革热、寨卡、基孔肯雅热）的流行病学动态。本研究旨在利用分子技术，调查巴西里约热内卢州两个大西洋森林残余片段——Guapia?u生态保护区（REGUA）和Sítio Recanto Preservar（SRP）——内蚊虫的吸血来源，以期为蚊媒种群控制策略的制定提供科学依据。
材料与方法
研究区域
研究在Sítio Recanto Preservar（SRP，席尔瓦雅尔丁市）和Guapia?u河生态保护区（REGUA，卡舒埃拉斯-迪马卡库市）进行。SRP位于圣若昂河流域环境保护区，降雨丰富，年降水量约2400毫米，植被主要为茂密的全绿林，包括山地、亚山地和低地森林。REGUA是大西洋森林的残余片段，位于瓜纳巴拉湾子流域，面积7400公顷，植被类型包括洪泛平原森林、亚山地森林和冲积森林。该地区气候夏季炎热多雨，冬季寒冷干燥，年平均气温23°C，年降水量约2560毫米。REGUA拥有丰富的动物多样性，包括约67种两栖动物、455种鸟类、45种爬行动物和61种哺乳动物。
标本捕获、储存及饱血雌蚊鉴定
蚊虫采集使用CDC光诱陷阱，安装高度为2米，于傍晚6点至次日早上8点进行。在SRP的采集时间为2023年2月至4月及8月至10月；在REGUA的采集时间为2023年3月至2024年2月。REGUA设立两个采样点：1号点（黄色小径）靠近保护区总部，地势低，环绕湖泊，植被为重新引入的本地物种混合；2号点（绿色小径）位于亚山地带，海拔较高，为茂密多样的森林。SRP采样点则具有密集的灌木层，树木高大且间距近。捕获的蚊虫置于聚乙烯笼中，冷藏运输至实验室，经氯仿麻醉后于4°C保存以中止消化过程。蚊虫标本在制冷台上进行雌雄分离，并依据经典分类学钥匙进行物种鉴定，随后于-80°C超低温冰箱保存以备分子分析。
分子分析
DNA提取使用TransGen Biotech的EasyPure Viral DNA/RNA试剂盒，从蚊虫头胸部及腹部（饱血蚊）研磨物中进行。DNA质量与浓度使用Denovix DS-11 FX分光光度计检测，仅质量合格的样本进入后续分析。采用两对针对脊椎动物线粒体细胞色素b（Cytb）基因的通用引物（L14841/H15149和VF/VR）进行PCR扩增，这些引物不扩增蚊虫自身DNA。PCR反应体系为25μL，包含MgCl2、dNTPs、引物、缓冲液、Taq DNA聚合酶和模板DNA。扩增程序包括初始变性、35个循环的变性-退火-延伸及最终延伸步骤。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用PCR纯化试剂盒进行纯化，纯化产物送交FIOCRUZ的RPT-01A测序平台进行Sanger测序。
序列分析
测序获得的序列使用Geneious R11软件进行处理。通过与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，并使用MUSCLE算法进行序列比对，来鉴定吸血来源。当序列相似性大于95%时，判定为该脊椎动物为食物来源。
结果
共捕获1714只蚊虫，其中SRP点653只（21种），REGUA点1061只（31种）。仅有145只雌蚊（占总数的8.46%）处于饱血状态。分子分析显示，其中55个饱血样本（37.93%）成功扩增出宿主DNA，其余90个样本未能检测到血餐来源。
在SRP点，21只饱血雌蚊中，8只（9.5%）成功扩增，其中4只的血餐来源得到鉴定：3只Psorophora ferox和1只Aedes scapularis。
在REGUA点，124只饱血雌蚊中，47只（37.90%）成功扩增。绿色小径点捕获的80只蚊虫中仅有7只饱血，但未能鉴定出食物来源；黄色小径点捕获的955只蚊虫中有117只饱血，其中20只的血餐来源得到鉴定，涉及Uranotaenia geometrica、Coquillettidia fasciolata、Cq. venezuelensis、Ae. scapularis、Ae. serratus(s.l.)、Ae. albopictus、Anopheles evansae、An. evandroi和Culex (Melanoconion)sp.等多个物种。
在24份成功鉴定的样本中，血餐来源包括18份人类血液、1份两栖动物血液、6份鸟类血液、1份犬科动物血液和1份鼠类血液。其中两例样本检测到混合血餐：一例Cq. venezuelensis同时吸食了两栖动物和人类血液；一例Cq. fasciolata同时吸食了鼠类和鸟类血液，另一例则同时吸食了人类和鸟类血液。有两份样本仅鉴定到鸟类属级水平。尽管所有序列相似性均大于95%，但仅有对应人类的序列被数据库接受并可用于发表，其他来源（两栖动物、鸟类、犬科、鼠类）的序列因质量较低（长度小于200 bp）而未被NCBI数据库收录。
讨论
本研究结果凸显了在规划蚊媒控制策略和预防虫媒病毒传播时，除考虑人类活动外，还需重点关注蚊虫的行为和取食偏好。大西洋森林的生物多样性正受到森林砍伐的严重威胁。原生植被的丧失与虫媒病毒（如登革热、寨卡、基孔肯雅热、黄热病）传播风险的增加相关，生境改变会影响蚊媒种群密度，并促使它们向居民区扩散。
对Ae. scapularis的检测结果（分别吸食人类和鸟类血液）与此前研究一致，表明该物种具有广食性。Coquillettidia fasciolata被发现吸食人类、鼠类和鸟类血液。值得注意的是，研究中鉴定出的某些鸟类（如两种鸥类）在REGUA地区并无分布记录，尽管序列相似性符合要求，但这可能源于鸟类长距离迁徙，或提示测序分析过程中存在误差，强调了结合脊椎动物分布信息进行结果判读的重要性。
分子生物学技术（如基于PCR的方法）在血餐鉴定中存在局限性，包括蚊虫腹部宿主DNA的质量和数量、标本的保存运输条件以及DNA降解等。本研究的成功扩增率为37.93%，与其他研究结果存在差异。此外，本研究所用的Sanger测序技术存在方法学局限，当存在混合血餐时，其只能检测浓度最高的目标，可能导致色谱图出现多重峰而难以准确鉴定。短引物（小于25 bp）的使用也可能导致结果冲突和特异性降低。下一代测序（NGS）技术有望在未来提高检测的准确性和灵敏度。
研究发现，在成功鉴定血餐来源的蚊种中，包括Ae. albopictus（登革热、黄热病、寨卡、基孔肯雅热病毒载体）、Ae. serratus(s.l.)、Ae. scapularis和Ps. ferox（黄热病病毒载体）等多种重要媒介物种均检测到人类血液，表明捕获的蚊种存在明显的向人类宿主取食的倾向。这种倾向很可能与森林片段中居民、游客和研究人员的频繁活动有关。蚊虫具有行为可塑性，当环境中脊椎宿主数量减少时，可能转向以人类作为替代血源。物理化学因素（如视觉、嗅觉、热量、湿度）和行为机制共同介导了蚊虫对脊椎动物宿主的搜寻和定位。例如，Cq. fasciolata和Ps. ferox被发现可飞行平均2500米的距离寻找宿主。
综上所述，本研究揭示了大西洋森林残余片段中蚊虫的取食行为以人类为主，这与其媒介潜能及当地的人类活动密切相关。研究结果强调了持续改进蚊虫采集和分子鉴定技术的重要性，以更精确地揭示蚊虫与环境的相互作用，从而为制定有效的蚊媒和虫媒病毒控制政策提供关键信息。
