基于LC-ICP-MS酪氨酸碘化法的体外甲状腺过氧化物酶抑制评估：与Amplex Ultrared法的比较及其优化研究

《Archives of Toxicology》：In vitro thyroperoxidase inhibition assessment by LC-ICP-MS-based L-tyrosine iodination assay: comparison with Amplex Ultrared assay and its modifications

本研究针对环境化学品干扰甲状腺激素系统的关键问题，开发并优化了基于LC-ICP-MS的酪氨酸碘化(Tyr-I)法，用于评估甲状腺过氧化物酶(TPO)抑制活性。通过与Amplex UltraRed(AUR)法及其改良方法的系统比较，发现Tyr-I法通过同时检测过氧化和碘化步骤，显著提高了检测灵敏度，对苯酚2和间苯二酚等人类暴露相关化合物的有效浓度低至15-74 nM。该研究为甲状腺激素系统干扰化学物的高效测试策略提供了科学可靠的方法学支持。

　　

在我们日常生活中，从个人护理用品到食品包装，从电子产品到儿童玩具，成千上万种化学物质正通过各种途径进入人体。这些环境化学品中，有一类特别令人担忧的内分泌干扰物(EDCs)，它们能够以极低浓度干扰激素调节系统，其中甲状腺激素系统(THS)是近年来备受关注的重要靶点。甲状腺激素在早期大脑发育、能量代谢和生长发育过程中扮演着关键角色，其功能紊乱与儿童神经发育障碍、认知缺陷、行为异常以及野生动物繁殖障碍等多种不良健康效应密切相关。

尽管评估化学品对甲状腺激素系统的干扰效应具有重要现实意义，但目前的测试方法主要依赖动物实验，不仅耗时耗力，还面临伦理争议，难以满足大规模化学品快速筛查的需求。特别是针对甲状腺激素合成过程中的关键酶——甲状腺过氧化物酶(TPO)的抑制效应评估，现有体外方法存在明显局限性。TPO负责催化甲状腺激素合成的三个关键反应：碘离子氧化、酪氨酸碘化以及碘化酪氨酸偶联，是甲状腺激素系统干扰的重要分子起始事件。

正是在这一背景下，发表在《Archives of Toxicology》上的这项研究开展了创新性方法学比较。研究人员旨在解决现有TPO抑制评估方法灵敏度不足、生理相关性有限的问题，通过系统比较基于高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS)的酪氨酸碘化(Tyr-I)法与荧光检测的Amplex UltraRed(AUR)法及其改良方法，为甲状腺激素系统干扰化学物的高效评估提供科学依据。

研究团队采用了几个关键技术方法：首先利用转染人TPO的HEK-TPOA7细胞系作为人源TPO酶来源，同时制备大鼠甲状腺微粒体作为种间比较的参照；其次建立了基于LC-ICP-MS的Tyr-I检测方法，专门监测L-酪氨酸向一碘酪氨酸(MIT)的转化过程；第三，对传统AUR法进行改良，通过添加碘化钠和L-酪氨酸增强其生理相关性；最后采用21种代表不同用途类别的化学品进行系统评估，浓度范围覆盖0.002-200μM。

酪氨酸碘化(Tyr-I)法的建立与优化

研究人员成功建立了基于LC-ICP-MS的Tyr-I检测方法，该方法能够特异性检测TPO催化下L-酪氨酸向MIT的转化过程。通过系统优化反应条件，该方法对MIT和DIT的定量限分别达到16nM和4.6nM，灵敏度优于既往报道的LC-MS/MS方法。质量控制实验证实，MIT的合成需要所有必需组分：L-酪氨酸、碘化物和过氧化氢，同时适当的背景对照可有效排除非酶促MIT生成的干扰。

Tyr-I法与AUR法的灵敏度比较

研究结果显示，Tyr-I法在检测TPO抑制方面表现出显著优势。在测试的21种化合物中，14种被鉴定为TPO抑制剂，其中苯酚2(BP2)和间苯二酚(RSC)的抑制效力最强，IC₅₀值分别为0.022μM和0.015μM。与标准AUR法相比，Tyr-I法对所有有效化合物都显示出更强的抑制效果，IC₅₀值普遍低20倍以上。特别值得注意的是，氨苄青霉素(AMP)和乙撑硫脲(ETU)等在AUR法中无显著抑制的化合物，在Tyr-I法中表现出明确的剂量-效应关系，这凸显了Tyr-I法在检测弱效TPO抑制剂方面的优越性。

跨物种TPO抑制效应比较

通过比较人源HEK-TPOA7细胞系与大鼠甲状腺微粒体的TPO抑制效应，研究发现大多数化合物在两个系统中表现出相似的抑制趋势。BP2、甲巯咪唑(MMI)和丙基硫氧嘧啶(PTU)等化合物在人和大鼠TPO中的IC₅₀值高度一致，而双酚A(BPA)、RSC和三氯生(TCS)等在大鼠系统中的IC₅₀值略高，但差异均在6倍以内。这一发现支持了利用大鼠TPO数据预测人TPO抑制效应的可行性，同时凸显了人源体外模型的优势，因其完全符合3R原则(替代、减少和优化动物使用)。

AUR法的改良与性能提升

研究团队对传统AUR法进行了重要改良，发现添加碘化钠可显著提高检测灵敏度。在500μM碘化钠存在下，AUR法可识别出14种TPO抑制剂，而标准AUR法仅识别出8种。特别值得注意的是，碘化钠的添加使得三碘甲状腺原氨酸(T3)和磺胺甲噁唑(SMX)等化合物从无活性变为可量化IC₅₀值的活性化合物。然而，同时添加L-酪氨酸反而降低了荧光信号强度，可能由于酪氨酸竞争消耗过氧化氢所致。

不同检测方法的适用性评估

研究结果表明，碘化钠改良的AUR法具有高通量优势，适合大规模化学品的初步筛查；而Tyr-I法则因其更高的灵敏度和生理相关性，更适合用于确证性测试和机制研究。特别是对于像ETU这样主要通过干扰碘化步骤发挥抑制作用的化合物，即使改良的AUR法也可能漏检，而Tyr-I法则能可靠识别。

综合研究结果，该研究得出以下重要结论：基于LC-ICP-MS的Tyr-I法在检测TPO抑制方面具有显著优势，其灵敏度远高于传统AUR法；碘化钠改良的AUR法可作为高通量筛查的有效工具；人源TPO体外模型与大鼠微粒体模型结果具有良好一致性，支持跨物种数据外推的可行性。

这项研究的科学意义在于首次直接比较了基于过氧化和碘化两种不同原理的TPO抑制检测方法，为甲状腺激素系统干扰化学物的评估提供了方法学指导。研究建立的Tyr-I法不仅灵敏度高，而且完全符合3R原则，为替代动物实验提供了可靠工具。同时，碘化钠改良的AUR法为环境混合物等复杂样品的高通量筛查提供了实用方案。这些方法学的进步将有力推动甲状腺激素系统干扰化学物的风险评估和监管决策，对保护人类健康和生态环境具有重要意义。