《Journal of Future Foods》：Genome-scale metabolic modeling of
Pichia kudriavzevii reveals citric acid utilization mechanisms and engineering strategies for improved wine deacidification
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本研究针对果酒高酸度影响风味平衡的产业难题，聚焦具有强柠檬酸代谢潜力的非酿酒酵母——库德里阿兹威氏毕赤酵母（PK）。研究人员通过整合基因组测序与基因组尺度代谢模型（GSMM），构建了高质量模型iQS924，系统阐明了PK在葡萄糖和柠檬酸条件下的代谢差异，揭示了其柠檬酸同化伴随三羧酸（TCA）循环增强、糖异生和氧化还原平衡等特征。通过转录组数据整合与计算机模拟，鉴定出关键遗传干预靶点（如上调SCT1可显著提升混合碳源下柠檬酸摄取比例），为通过代谢工程优化PK的降酸效率提供了理论框架和策略，对提升果酒品质具有重要意义。
想象一下，一杯优质的葡萄酒，其风味应该是醇厚、平衡而愉悦的。然而，过高的酸度往往会打破这种平衡，带来尖锐的酸涩感和粗糙的口感，令消费者望而却步。果酒（包括葡萄酒）的酸度通常远高于适宜饮用的范围，因此，在酿造过程中进行适当的降酸处理至关重要。传统的化学降酸法可能引入不良风味，而物理方法成本高昂且可能改变酒体成分。相比之下，利用微生物在发酵过程中降解有机酸的生物降酸法，因其更天然、更可控而备受青睐。在众多具有降酸潜力的微生物中，库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii， PK）脱颖而出。它不仅能耐受酸性环境（pH < 4.0），还能有效降解柠檬酸、苹果酸等多种有机酸，甚至能增强葡萄酒的整体香气，被认为是一种极具潜力的葡萄酒发酵启酵剂。然而，人们对PK代谢有机酸，特别是其响应不同碳源（如葡萄糖和柠檬酸）的遗传和代谢基础仍知之甚少，这限制了其在发酵优化中的全面应用。
为了深入解析PK的代谢奥秘，西北农林科技大学葡萄酒学院的孙青、吴越、程一超、王浩、陶士恒、宋宇阳和刘彦林等研究人员在《Journal of Future Foods》上发表了他们的研究成果。他们结合基因组测序与基因组尺度代谢建模，旨在阐明PK利用柠檬酸的代谢基础，并寻找在葡萄酒发酵中提高其效率的策略。
研究人员主要运用了几项关键技术方法：首先，对PK GS1-1菌株进行了PacBio Sequel平台的三代基因组测序和高质量组装注释。其次，基于基因组注释结果，利用CarveMe工具自动重建并经过大量手动优化的流程，构建了高质量的基因组尺度代谢模型（Genome-Scale Metabolic Model， GSMM）iQS924。该模型包含924个基因、1431个代谢物和1199个反应。再者，通过在不同单一碳源上培养PK并进行生长表型实验，验证了模型的预测准确性（准确率达90%）。此外，研究还整合了公开的RNA测序（RNA-seq）数据，利用相对表达代谢组学整合（REMI）算法将转录组信息约束模型，模拟葡萄糖（GLC）和柠檬酸（CIT）条件下的代谢通量分布。最后，利用OptFlux平台进行多目标优化模拟，识别能够增强柠檬酸利用的潜在遗传修饰靶点。
3.1. 基因组组装与PK GS1-1代谢网络构建
研究人员对PK GS1-1菌株进行了基因组测序和组装，获得了10.8 Mb的基因组。基于此，他们构建了高质量的基因组尺度代谢网络模型iQS924。与先前发表的模型iIsor850相比，iQS924的基因数量增加至924个，并且大幅减少了非功能性反应（阻塞反应从639个降至68个），模型质量显著提升，为后续模拟分析奠定了可靠基础。
3.2. 通过生长表型验证模型
研究人员测试了PK在20种不同单一碳源上的生长情况。模型预测与实验结果高度一致，准确率达到90%，证明了iQS924模型能够可靠地模拟PK的碳源代谢能力。
3.3. 葡萄糖和柠檬酸条件下的生长特性
生长曲线分析显示，PK在葡萄糖条件下适应快、生长迅速；而在柠檬酸条件下，则表现出较长的延滞期，但最终能达到与葡萄糖条件相当的生物量。这表明PK虽然优先利用葡萄糖，但也具备有效利用柠檬酸作为碳源的能力。
3.4. 葡萄糖和柠檬酸条件下的必需基因和反应
通过模型模拟，研究人员识别了在葡萄糖和柠檬酸作为唯一碳源条件下PK生长所必需的基因和反应。结果表明，两种条件下绝大多数必需基因和反应是重叠的，主要富集在氨基酸代谢、碳代谢和能量代谢等核心通路，构成了保守的代谢基础。同时，研究发现某些关键反应由同工酶调控，且这些同工酶在不同碳源条件下的转录水平存在显著差异，提示细胞可能通过选择不同的同工酶来优化特定环境下的代谢。
3.5. 两种碳环境下的通量模拟与比较
整合转录组数据后，模型模拟揭示了PK在柠檬酸和葡萄糖条件下截然不同的代谢模式。在柠檬酸条件下，由于缺乏葡萄糖，糖异生活性增强以维持葡萄糖依赖性代谢；柠檬酸的直接输入显著增强了TCA循环的通量；乙醇发酵等厌氧呼吸途径通量降低，能量产生更依赖于高效的有氧呼吸；磷酸戊糖途径、脂肪酸合成等通量普遍下降，而β-氧化增强，表明代谢从合成代谢向分解代谢转移；氨基酸代谢在碳氮节点也发生协调性变化，与支链高级醇合成相关的通量减少，这可能有助于改善果酒的风味。
3.6. 优化柠檬酸利用的代谢工程策略
为了提升PK在葡萄酒发酵（通常同时存在葡萄糖和柠檬酸）环境下的柠檬酸利用效率，研究人员利用模型模拟了遗传修饰策略。多目标优化模拟筛选出18个潜在的遗传修饰策略，涉及21个基因。值得注意的是，77.8%的策略建议上调SCT1基因（编码甘油-3-磷酸酰基转移酶）的表达。模拟显示，仅上调SCT1就可使预测的柠檬酸与葡萄糖摄取比率从0.01大幅提升至0.93。这表明增强脂质生物合成能力可能通过促进柠檬酸衍生的乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）周转，来缓解反馈抑制并维持代谢流，从而促进柠檬酸利用。其他潜在靶点还包括下调次级代谢基因ERP6或锌转运蛋白基因ZRT1等。
该研究成功构建了高质量的PK基因组尺度代谢模型iQS924，系统揭示了其在柠檬酸条件下的代谢重塑特征，包括TCA循环增强、糖异生活化以及氧化还原平衡的调整。通过整合多组学数据与计算模拟，研究不仅深化了对PK有机酸代谢机制的理解，更重要的是提出了切实可行的代谢工程策略。特别是上调SCT1基因表达被预测能有效逆转PK在混合碳源中对葡萄糖的偏好，显著提高柠檬酸利用率。这些发现为通过理性设计改造PK菌株，增强其在果酒发酵中的生物降酸能力提供了重要的理论依据和技术路线，对开发高效、可控的果酒发酵工艺，提升果酒风味品质具有积极的推动作用。
