《Journal of Hazardous Materials》：Landscape of Environmental Pollutant–Driven Alterations of Nucleic Acid Modifications in Hepatoma Cells
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环境污染物通过重塑DNA和RNA表观遗传修饰景观影响人类健康，本研究开发LC-MS/MS方法检测18类污染物（双酚类、全氟化合物等）诱导的2种DNA甲基化（5mC/5hmC）和15种RNA修饰变化，揭示污染物-剂量依赖的表观遗传互作网络，为毒性机制研究提供新视角。
天锋|姚华古|邱双胡|聂斌谢|舒毅古|方音刚|熊军|毕峰袁
武汉大学公共卫生学院职业与环境健康系，放射与医学肿瘤学系，中南医院；中国国家重点实验室（复杂生物体代谢与调控），武汉大学国家卫生健康委员会食品安全风险评估与标准制定专业实验室，武汉430071，中国
摘要
越来越多的证据表明，环境污染物对人类健康构成了广泛的风险。这些污染物已在多种人体器官中被检测到，引发了对其潜在毒性的担忧。除了传统的毒性途径外，许多污染物还通过干扰表观遗传机制来破坏生物系统。核酸修饰在基因调控中起着关键作用，探索环境污染物引起的核酸修饰变化可以为我们提供关于其毒性和健康影响的新见解。在这项研究中，我们开发了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量两种DNA修饰（5mC和5hmC）和十五种RNA修饰。然后，我们系统地评估了十八种污染物（包括双酚类（BPs）、全氟和多氟烷基物质（PFASs）、邻苯二甲酸酯（PAEs）、重金属（metals）和有机磷酸酯（OPEs））暴露后这些修饰的变化。结果表明，污染物暴露显著改变了核酸修饰的格局，并呈现出污染物和剂量特异性的模式。值得注意的是，相关性网络分析显示，环境污染物暴露重塑了DNA和RNA修饰之间的相互作用，这表明这些表观遗传标记之间的相互作用是环境污染物表观遗传毒性的新机制。这些发现强调了从核酸表观遗传学的角度全面理解环境污染物毒性的必要性。总体而言，这些数据支持环境污染物选择性地干扰DNA和RNA的表观遗传标记，为暴露评估提供了潜在的标志。
引言
环境污染物被广泛认为是对人类健康的主要威胁，包括各种物质[1]、[2]、[3]。它们存在于许多消费品中，如塑料、化妆品、食品包装、纺织品、电子产品和建筑材料[4]、[5]。环境污染物的广泛分布引发了人们对它们可能破坏生物系统的紧迫担忧，从而导致各种疾病的发病和进展[6]、[7]、[8]、[9]。据估计，由于环境暴露（如重金属、颗粒物和内分泌干扰化学物质），每年有900万到1260万人死亡[6]。自1950年以来，已经合成了超过14万种新的化学物质和农药[10]。然而，它们对健康的影响在很大程度上仍然未知[6]。此外，癌症的发展是内在遗传因素和外在环境因素共同作用的结果，其中70-90%是由外在环境因素引起的[11]。
双酚类（BPs）和邻苯二甲酸酯（PAEs）是常用的增塑剂和添加剂，用于提高塑料的柔韧性和耐用性，但由于它们的内分泌干扰能力而受到关注[12]。接触BPs，特别是双酚A（BPA）及其类似物（如双酚S（BPS）和双酚F（BPF），与生殖异常、代谢综合征和癌症风险增加有关[13]、[14]、[15]。同样，PAEs在个人护理产品和包装中的广泛使用也与激素紊乱、发育毒性和不良代谢结果相关[16]、[17]。重金属和类金属，如镉（Cd）、砷（As）、铅（Pb）和锰（Mn），是另一类重要的污染物，以其神经毒性、肾毒性和致癌性而闻名[18]、[19]、[20]。此外，全氟和多氟烷基物质（PFASs）是一种高度持久的合成化学物质，因其防水和防油性能而被广泛使用，但由于其生物累积性和与免疫功能障碍、内分泌干扰和致癌作用的相关性而受到关注[21]、[22]。阻燃剂，如有机磷酸酯（OPEs），由于其神经毒性和内分泌干扰潜力，进一步加剧了人们的担忧，这些物质经常在通过家庭灰尘和受污染的食物来源暴露的人群中观察到[23]。
环境污染物暴露会影响调节基因表达的表观遗传因素，从而促进疾病的发展[24]、[25]、[26]。DNA甲基化和羟甲基化主要发生在胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸上，在基因表达、基因组稳定性和细胞分化中起着关键作用[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。污染物暴露引起的异常甲基化模式与基因调控紊乱、慢性炎症状态、异常细胞增殖以及代谢和激素信号通路受损有关[32]。例如，双酚暴露已被证明会改变参与生殖健康、葡萄糖代谢和肿瘤抑制途径的基因的DNA甲基化模式，从而显著促进疾病进展[33]。同样，重金属暴露与关键肿瘤抑制基因的全球DNA低甲基化或高甲基化有关，从而促进癌症和慢性疾病（如心血管疾病和糖尿病）的发展[34]。
除了DNA修饰外，RNA甲基化，特别是N6-甲基腺苷（m6A），最近被认为是一种关键的表观遗传调节因子，在细胞代谢、免疫反应和致癌过程中具有广泛的影响[35]、[36]。RNA修饰通过其动态和可逆的性质，深刻影响RNA的稳定性、翻译效率和定位[37]、[38]、[39]。环境污染物，如重金属和PFASs，越来越多地被认为会改变m6A修饰谱型，从而破坏RNA代谢和下游生物过程[40]、[41]。例如，砷（As）和铅（Pb）的暴露与m6A模式的改变有关，这显著影响了与应激反应、炎症和细胞增殖相关的基因表达[40]、[42]。此外，PFAS暴露还显示出RNA甲基转移酶和去甲基化酶活性的潜在紊乱，表明污染物可能是通过这种机制促进疾病发展和进展的[41]。
尽管在理解环境污染物的急性和遗传毒性效应方面取得了相当大的进展，但对其表观遗传后果的研究仍然有限。虽然之前的研究已经调查了几种污染物引起的DNA甲基化改变，但对多种环境污染物对DNA和RNA中多种表观遗传修饰影响的全面理解仍然难以实现。在这项研究中，我们开发了一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于定量分析两种DNA修饰和十五种RNA修饰。随后，我们系统地探讨了由18种环境污染物引起的这两种DNA修饰和十五种RNA修饰的变化，这些污染物属于五类：双酚类（BPs）、PFASs、PAEs、重金属和OPEs。
部分片段
化学物质和试剂
从各种商业供应商处获得了十八种环境污染物标准（表S1）。这18种环境污染物被分为五类：双酚类（BPs）、PFASs、PAEs、重金属和OPEs。具体来说，BPs包括BPA、BPS、BPF和双酚AF（BPAF）。PFASs包括全氟辛酸（PFOA）、全氟戊酸（PFPeA）、全氟壬酸（PFNA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）。PAEs包括单乙基邻苯二甲酸酯（MEP）、二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）
通过LC-MS/MS定量检测DNA和RNA修饰
我们首先建立了一种LC-MS/MS方法，用于全面分析DNA和RNA修饰（图1和图S1）。在优化条件下，我们检测了两种DNA修饰（5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）以及十五种RNA修饰，包括N1-甲基腺苷（m1A）、m6A、N6-苏氨酸酰胺腺苷（t6A）、2′-O-甲基腺苷（Am）、肌苷（I）、1-甲基肌苷（m1I）、5-甲基尿苷（m5U）、2′-O-甲基尿苷（Um）、5,2′-O-二甲基尿苷（m5Um）、2′-O-
结论
总之，这项研究提供了一个关于环境污染物如何影响人类细胞中DNA和RNA修饰的稳健、综合的图谱。使用灵敏的LC-MS/MS方法，我们量化了十八种污染物中的两种DNA修饰（5mC和5hmC）和十五种RNA修饰，揭示了污染物和暴露持续时间依赖的修饰扰动特征。除了PFPeA和PFNA外，所有研究的污染物都表现出显著的影响
环境影响
环境污染物对人类健康构成了广泛的风险。我们系统地研究了十八种环境污染物（涵盖五类）如何改变两种类型的DNA表观遗传修饰和十五种RNA表观遗传修饰。结果表明，污染物暴露显著改变了核酸修饰的格局，并表现出污染物和剂量特异性的模式。相关性网络分析显示，污染物暴露重塑了
作者贡献
本手稿的撰写得益于所有作者的贡献。所有作者均已批准最终版本的手稿。
CRediT作者贡献声明
方音刚：数据管理。舒毅古：数据管理。聂斌谢：正式分析、数据管理。邱双胡：验证、方法学、正式分析、数据管理。毕峰袁：写作-审稿与编辑、监督、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念化。熊军：写作-审稿与编辑、监督、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念化。姚华古：验证、正式分析、数据
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2022YFA0806600, 2022YFC3400700）、国家自然科学基金（22277093, 22207090, 22574125）以及湖北省自然科学基金联合基金（2024AFD101）的支持。
