一种用于L-选择素的超灵敏分裂适配体传感器：将切割酶辅助的3D DNA行走器技术与CRISPR-Cas12a信号放大技术相结合

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：An ultrasensitive Split-Aptasensor for L-selectin: Integrating nicking enzyme-assisted 3D DNA Walker with CRISPR-Cas12a signal amplification

L-selectin检测新型荧光生物传感器研发：采用分裂aptamer与CRISPR-Cas12a联用及3D-DNA漫步技术，实现0.45 ng/mL超灵敏检测，线性范围10-1280 ng/mL，有效应用于人体血液样本的定量分析，为炎症和免疫相关疾病提供高精度诊断工具。

　　

李周|焦贤伟|张玉婷|严长岭

河南师范大学体育学院，中国河南省新乡市453007

摘要

L-选择素是一种白细胞粘附受体，在粘附级联反应的早期阶段起着关键作用，有助于白细胞在炎症和免疫监视过程中迁移到周围组织。临床研究表明，L-选择素是治疗多种急性和慢性炎症疾病的潜在候选药物。阐明L-选择素附近的细胞信号通路可能会为特定细胞类型或疾病提供独特的治疗方法。本研究描述了一种基于L-选择素特异性裂解适配体的精确且灵敏的荧光生物传感器的开发过程。该传感器利用切割酶辅助的DNA行走技术和CRISPR-Cas12a实现双信号放大。L-选择素的校准曲线显示检测限为0.45 ng/mL，线性范围为10至1280 ng/mL。荧光传感器在人类血液样本中有效检测到了L-选择素，取得了优异的结果。

引言

• L-选择素是一种I型跨膜细胞粘附糖蛋白，主要表达在大多数循环白细胞表面[1]。通过对L-选择素缺陷小鼠的研究，阐明了这种蛋白质在生理和病理状态下的关键作用，尤其是在调节白细胞向外周淋巴结（例如幼稚T细胞）以及急性和慢性炎症区域（例如单核细胞和中性粒细胞）的迁移方面[2]，[3]。临床研究进一步表明L-选择素是治疗多种急性和慢性炎症疾病的潜在靶点[4]，[5]。揭示L-选择素下游的细胞内信号通路可能发现针对特定细胞类型或疾病的新型治疗靶点[6]，[7]。因此，准确测定L-选择素水平对疾病预防、诊断和靶向治疗具有重要意义。

适配体能够精确识别蛋白质、小分子、DNA、RNA和其他物质[8]，[9]，[10]。尽管最近开发的适配体为L-选择素的检测提供了有力工具，但大多数基于适配体的方法灵敏度有限且背景噪声较大[11]，[12]，[13]。片段化适配体在缺乏目标时结构重塑能力受限，导致其信号响应不如完整的原始适配体强[14]，[15]，[16]。然而，片段化适配体在无目标情况下是非功能性的且独立的，从而减少了假阳性和非特异性信号[17]，[18]。裂解适配体方法构建的传感平台具有出色的准确性、精确度和信噪比[19]，[20]，[21]。尽管如此，由于需要整合信号放大策略，这些检测方法仍面临灵敏度不足的挑战[22]，[23]。实际上，将信号放大技术应用于大多数基于有机探针的荧光生物传感器仍然非常具有挑战性[24]，[25]，[26]。因此，探索一种能够调节信号放大过程的新型荧光传感平台对于提高细胞内L-选择素监测效率至关重要。

DNA行走器是一种高度敏感的核酸放大工具，能够将化学能转化为机械运动，并在分子尺度上执行类似机器的功能[27]。Nt.BsmAI是一种限制性内切酶，仅切割双链DNA中的一个链。它可以作为切割酶辅助的DNA行走工具[28]。通过将化学振动转化为机械运动，DNA行走器降解目标链，生成单链产物以实现信号放大和目标检测[29]。纳米颗粒的高表面积与体积比使得多个链可以整合到基于圆柱形核酸（SNA）的3D-DNA行走器中[30]，[31]。这显著提高了区域内的DNA浓度，从而增强了行走效率和过程性[32]，并实现了快速且显著的信号放大，从而提高了检测灵敏度[33]。尽管取得了显著进展，但现有系统大多未能达到所需的灵敏度[34]。准确的疾病诊断和疾病进展监测需要能够在低浓度下检测核酸。

本研究介绍了一种先进的超灵敏L-选择素检测方法，该方法结合了CRISPR/Cas12a荧光放大系统和3D-DNA行走器级联放大过程。如图1所示，裂解适配体S1通过生物素化固定在磁珠（MBs）上。在目标L-选择素存在的情况下，裂解适配体S1和S2表现出选择性结合能力。当引入Nt.BsmAI限制性内切酶时，S1的发夹结构沿核苷酸序列被特异性切割，释放出S2。随后，S2与下一个发夹结构结合，启动3D-DNA行走器级联反应并释放大量激活剂DNA。最终，在CRISPR/Cas12a/crRNA复合物的作用下，激活剂DNA能够被精确识别并结合，从而激活Cas12a的切割功能，无差别地分解所有单链DNA（F-Q），从而实现荧光放大。因此，利用这种生物传感器作为介质，可以通过荧光信号响应定量和准确地监测目标L-选择素。

化学与材料

链霉素修饰的磁珠购自Yeasen Biotechnology（中国上海）。L-选择素来自Novus Biologicals（美国）。Nt.BsmAI和Lbacas12a酶购自New England BioLabs Ltd.（中国北京）。上海Sangon Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）合成并修改了表S1中列出的DNA或RNA分子（见补充材料）。其他化学品购自Aladdin Co., Ltd.（中国上海）。所有其他试剂

利用双信号放大器识别L-选择素的荧光适配体机制

图1展示了用于检测L-选择素存在的双输出放大荧光适配体的分解视图。S1和S2是根据先前的研究发现设计的碱基序列[35]。在本研究中，使用了先前报道的L-选择素适配体序列，实现了对L-选择素的有效检测。在酶辅助的DNA行走过程中，不同发夹结构的中心链（S1）

结论

总结来说，我们成功设计并实现了一种基于片段化适配体的3D-DNA行走器，与CRISPR-Cas系统集成，实现了L-选择素的超灵敏检测。该传感器表现出优异的响应性，线性检测范围为10至1280 ng/mL，检测限为0.45 ng/mL。该方法对L-选择素具有显著的选择性，并已有效用于定量评估

CRediT作者贡献声明

李周：撰写原始草稿、进行研究、数据整理。焦贤伟：验证结果、软件开发、正式分析。张玉婷：撰写原始草稿、进行研究、数据整理。严长岭：指导研究、资源调配、方法学设计、资金争取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了河南省自然科学基金（编号：252300420250）的财政支持。