《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：KLK5 promotes anoikis resistance in non-small cell lung cancer by activating PI3K/AKT signaling pathway
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本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）转移和复发难题，聚焦KLK5在失巢凋亡抵抗（AR）中的作用机制。通过构建AR-H1299细胞模型，结合功能实验和通路分析，发现KLK5通过激活PI3K/AKT通路调控Bcl-2/Bad表达，从而增强NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。研究首次揭示KLK5-PI3K/AKT轴在AR中的关键作用，为NSCLC抗转移治疗提供了新靶点。
肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%。尽管精准医疗的发展提高了治疗精准度和五年生存率，但肿瘤转移和复发仍是导致患者死亡的主要原因。肿瘤细胞转移是一个复杂连续的过程，其中脱离细胞外基质的肿瘤细胞通常会发生一种特殊形式的凋亡——失巢凋亡（anoikis）。而部分脱落的肿瘤细胞能够抵抗失巢凋亡（即获得失巢凋亡抵抗，AR），这些细胞因此具备在循环系统中存活、黏附于微血管内皮、外渗至远处组织并最终在靶器官形成转移灶的潜力。研究表明，肿瘤细胞的转移潜能与其抗失巢凋亡能力呈正相关。因此，从诱导肿瘤细胞发生失巢凋亡或抑制其获得AR的角度寻找抑制NSCLC转移的治疗策略具有重要意义。
丝氨酸蛋白酶在癌症进展中扮演多种角色，其中组织激肽释放酶（KLK）家族是人类基因组中最大的丝氨酸蛋白酶簇。KLK5作为该家族成员之一，其在肺腺癌中的高表达与患者不良生存率相关，且PI3K/AKT等信号通路的激活已被报道可诱导AR。然而，KLK5在NSCLC失巢凋亡中的作用及其是否通过PI3K/AKT通路介导尚不清楚。为此，研究人员在《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》上发表论文，旨在阐明KLK5在NSCLC失巢凋亡抵抗中的作用及分子机制。
研究采用的主要关键技术方法包括：利用超低吸附板悬浮培养法构建稳定的失巢凋亡抵抗H1299细胞（AR-H1299）模型；通过慢病毒载体介导的RNA干扰（shRNA）和过表达技术调控KLK5基因表达；使用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验分别评估细胞增殖、克隆形成能力、凋亡、迁移和侵袭能力；通过蛋白质印迹法（Western blot）分析上皮间质转化（EMT）相关蛋白（E-钙黏蛋白、Vimentin）、转移相关蛋白（MMP2、MMP9）以及PI3K/AKT通路关键蛋白（PI3K、p85α、Akt、p-Akt）和凋亡调节蛋白（Bcl-2、Bad）的表达水平；并应用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002进行挽救实验验证通路作用。所有细胞系均来自商业渠道或机构库。
研究结果如下：
3.1. NSCLC细胞的失巢凋亡抵抗与KLK5表达呈负相关
通过检测多种NSCLC细胞系中KLK5的表达及其在悬浮培养5天后的凋亡情况，发现KLK5高表达的H1299细胞表现出AR特性，而低表达的H460细胞对失巢凋亡敏感，表明KLK5表达水平与NSCLC细胞的AR程度相关。
3.2. 失巢凋亡抵抗促进NSCLC细胞的恶性表型
成功建立的AR-H1299细胞与亲本细胞（P-H1299）相比，表现出更强的增殖能力、更低的凋亡率，以及迁移、侵袭能力增强。同时，AR-H1299细胞发生EMT，表现为Vimentin、MMP2、MMP9表达上调，E-钙黏蛋白表达下调。
3.3. 抑制KLK5表达降低AR-H1299细胞的恶性特性
在AR-H1299细胞中敲低KLK5后，细胞增殖、迁移、侵袭能力受到抑制，凋亡增加，且EMT进程受阻（Vimentin、MMP2、MMP9下调，E-钙黏蛋白上调），证明KLK5是维持AR-H1299细胞恶性表型的关键因子。
3.4. KLK5通过激活PI3K/AKT通路增强失巢凋亡抵抗
过表达KLK5能激活PI3K/AKT信号通路（上调PI3K、p85α、p-Akt），并调控下游凋亡相关蛋白（Bcl-2上调，Bad下调），进而促进细胞增殖、迁移、侵袭，抑制凋亡，并增强EMT。而使用LY294002抑制PI3K/AKT通路可逆转KLK5过表达带来的促恶性效应，证实KLK5通过PI3K/AKT通路介导AR。
研究结论与讨论部分指出，本研究首次揭示了KLK5通过激活PI3K/AKT信号通路，调控Bcl-2/Bad表达平衡，从而赋予NSCLC细胞失巢凋亡抵抗能力，并增强其转移潜能的分子机制。这不仅深化了对NSCLC转移机制的理解，而且将KLK5确立为潜在的预后生物标志物和抗转移治疗的新靶点。研究的局限性在于仅使用了一种细胞系和一种siRNA，未来需要在更多遗传背景不同的NSCLC细胞系中进行验证，并利用动物模型进一步证实其体内相关性，同时探索KLK5-PI3K/AKT轴调控凋亡的具体分子机制以及其他可能的下游效应信号网络。总之，靶向KLK5-PI3K/AKT轴有望成为抑制NSCLC转移的新型治疗策略。
