《LWT》：Antimicrobial Peptide NP-6-Loaded Chitosan Nanoparticles for the Preservation of Chilled Pork
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本研究针对游离抗菌肽稳定性差、易降解等问题，开发了基于离子凝胶法的壳聚糖纳米粒（NP-6-CS NPs）递送系统。通过单因素实验优化制备工艺，获得高包封率、粒径均一的纳米粒。表征证实NP-6成功负载，体外释放呈现Fickian扩散机制，并显著增强对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性。将其应用于冷藏猪肉保鲜，能有效抑制微生物增殖、延缓脂质氧化和蛋白质分解，维持肉品色泽和品质，为天然防腐剂开发提供了新策略。
在食品工业中，微生物污染导致的腐败变质是造成食物浪费和食品安全问题的主要因素之一。合成防腐剂虽然效果显著，但消费者对健康、天然产品的需求日益增长，促使研究人员寻找更安全的替代方案。抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）作为生物体先天免疫系统的重要组成部分，因其广谱抗菌活性和良好的安全性而备受关注。然而，游离抗菌肽在实际应用中面临诸多挑战：它们容易受到蛋白酶降解、对pH和温度等环境条件敏感，并且可能与食品基质成分发生相互作用，导致其生物利用度和体内功效降低。因此，如何提高抗菌肽的稳定性并实现其可控释放，成为食品保鲜领域的一个关键科学问题。
壳聚糖（Chitosan, CS）是一种天然阳离子多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性和成膜性，被广泛认为是活性物质递送的理想载体材料。特别是通过离子凝胶法与三聚磷酸钠（Tripolyphosphate, TPP）制备的壳聚糖纳米粒，其制备条件温和，无需有机溶剂，有利于保持肽的完整性。本研究基于前期从花椒籽中鉴定出的新型抗菌肽NP-6，旨在开发一种负载NP-6的壳聚糖纳米粒（NP-6-CS NPs），以克服游离肽的局限性，并评估其在冷藏猪肉保鲜中的应用潜力。该研究发表于《LWT - Food Science and Technology》期刊。
为开展本研究，研究人员主要采用了离子凝胶法制备NP-6-CS NPs，并通过单因素实验系统优化了壳聚糖溶液pH值、CS/NP-6/TPP质量比、壳聚糖浓度等关键配方参数，以包封率（Encapsulation Efficiency, EE%）、粒径、多分散指数（Polydispersity Index, PDI）和Zeta电位为评价指标。利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）、傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR）、X射线衍射（X-ray Diffraction, XRD）和差示扫描量热法（Differential Scanning Calorimetry, DSC）对纳米粒的形貌、结构和相互作用进行表征。通过体外释放实验研究NP-6的释放行为，并采用琼脂扩散法和微量肉汤稀释法测定纳米粒对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌活性和最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。最后，将优化后的NP-6-CS NPs应用于市售冷藏猪肉，在4°C贮藏期间定期检测样品的pH值、色泽（L, a, b*值）、挥发性盐基氮（Volatile Basic Nitrogen, TVB-N）、硫代巴比妥酸值（Thiobarbituric Acid Reactive Substances, TBARS）和总活菌数（Total Viable Count, TVC）等保鲜指标的变化，评估其实际保鲜效果。实验数据均进行三次重复，并采用SPSS软件进行统计学分析。
3. 结果与讨论
3.1. 不同负载条件对NP-6-CS NPs包封率、粒径、PDI和Zeta电位的影响
通过单因素实验系统考察了壳聚糖溶液pH、CS:NP-6质量比、CS:TPP质量比和壳聚糖浓度对纳米粒性质的影响。结果表明，溶液pH影响TPP的解离程度和壳聚糖氨基的质子化，进而影响交联效率；CS:TPP质量比决定了离子交联程度，过量TPP会导致纳米粒聚集；CS:NP-6质量比则关系到纳米粒的负载容量。最终确定最优制备条件为：CS:NP-6:TPP质量比6:3:2，壳聚糖浓度1 mg/mL，pH 4.8，反应时间30分钟。在此条件下，NP-6-CS NPs的包封率为48.03%，粒径为137.53 nm，PDI为0.39，Zeta电位为21.43 mV，表明形成了带正电荷且粒度分布相对较宽的纳米粒系统。
3.2. TEM观察
TEM图像显示，NP-6-CS NPs和未负载NP-6的空白壳聚糖纳米粒（UL-CS NPs）均呈不规则结构。NP-6-CS NPs的TEM观测直径（约40 nm）小于动态光散射法测得的流体动力学直径（137.53 nm），这可能是由于纳米粒在干燥制样状态下收缩，或在水中发生溶胀所致。与UL-CS NPs相比，NP-6-CS NPs的尺寸有所增加，证实了NP-6的成功负载。
3.3. FTIR分析
FTIR光谱分析揭示了各组分间的相互作用。与纯壳聚糖相比，NP-6-CS NPs的-NH/-OH伸缩振动峰从3494 cm-1红移至3432 cm-1且峰形变宽，酰胺I带从1663 cm-1移至1631 cm-1，C-O骨架振动峰（1074 cm-1）增强。这些变化表明，NP-6与壳聚糖基质之间形成了强烈的氢键作用，并且存在壳聚糖与TPP的离子交联，共同证明了NP-6被成功包封。
3.4. X射线衍射分析
XRD图谱显示，纯壳聚糖在9.24°和20.16°处有特征衍射峰，呈现半结晶结构。NP-6-CS NPs的衍射图中，壳聚糖的特征峰消失，在8.86°处出现新峰，且20°附近的峰变宽并移至20.76°。这表明离子交联过程破坏了壳聚糖原有的晶体结构，形成了更为无序的基质，同时NP-6以分子形式分散在壳聚糖网络中，而非以晶体形式存在，进一步证实了成功的包封。
3.5. 差示扫描量热分析
DSC曲线显示，纯NP-6在232°C处有一个吸热峰，对应于其变性过程。而在NP-6-CS NPs的DSC曲线中，未观察到NP-6的特征峰，表明NP-6已成功嵌入壳聚糖基质中，其晶体结构被破坏，以无定形状态存在，这与XRD结果相互印证。
3.6. 体外释放特性
NP-6-CS NPs在体外释放介质（PBS, pH 7.4）中呈现双相释放模式：前12小时为快速释放阶段（突释效应），累计释放约50%；随后释放速率减慢，36小时累计释放率达87.97%。释放动力学拟合表明，其释放行为最符合Korsmeyer-Peppas模型（R2=0.9641），释放指数n=0.2674<0.43，属于Fickian扩散机制。这种释放模式有利于食品保鲜，初始快速释放可迅速降低食品表面初始菌落数，后续缓慢释放则能维持长效抑菌浓度。
3.7. NP-6-CS NPs的细菌抑制特性分析
琼脂扩散法结果显示，NP-6-CS NPs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均产生明显的抑菌圈，直径分别为7.37 mm和8.49 mm，而游离NP-6仅对大肠杆菌有微弱抑制作用，空白纳米粒（UL-CS NPs）则无抑菌活性。微量肉汤稀释法测定NP-6-CS NPs对两种菌的MIC均为75 μg/mL。这表明纳米封装显著增强了NP-6的抗菌效果，其机制可能与纳米粒通过静电作用吸附于细菌细胞壁，在局部产生高浓度NP-6有关。
3.8. 冷藏猪肉保鲜效果
将NP-6-CS NPs应用于冷藏猪肉保鲜，评估其在10天贮藏期内对猪肉品质的影响。
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pH值变化：所有组别的pH值随贮藏时间延长而上升（因蛋白质分解产生碱性物质）。对照组在第6天pH值即超过6.7（变质标准），NP-6组在第8天超标，而NP-6-CS NPs处理组直至第8天pH值仍为6.24，属于次鲜肉范围，第10天才超标，显著延缓了pH上升。
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总活菌数变化：对照组和NP-6组的TVC在第3天即超过可接受限值（6.0 log CFU/g），而NP-6-CS NPs处理组直到第5天才超过此限值，将猪肉的货架期延长了2天。
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TVB-N和TBARS值变化：TVB-N（蛋白质分解指标）和TBARS（脂质氧化指标）值在贮藏期内均呈上升趋势。NP-6-CS NPs处理组的两项指标在整个贮藏期内均显著低于对照组和NP-6组，有效抑制了蛋白质分解和脂肪氧化。
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色泽变化：NP-6-CS NPs处理能更好地维持猪肉的亮度（L值）和红度（a值），并减缓黄度（b*值）的上升，表明其有效延缓了肌红蛋白氧化和脂质氧化产物的积累，保持了猪肉良好的感官色泽。
4. 结论
本研究成功通过离子凝胶法制备了负载抗菌肽NP-6的壳聚糖纳米粒（NP-6-CS NPs），并系统优化了其制备工艺。表征结果证实NP-6被成功包封于壳聚糖基质中。NP-6-CS NPs具有缓释特性，其释放行为符合Fickian扩散机制。与游离NP-6相比，纳米封装显著增强了对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性。在冷藏猪肉保鲜应用中，NP-6-CS NPs能有效抑制微生物生长，延缓蛋白质分解和脂质氧化，较好地维持猪肉的pH、色泽等品质指标，从而延长货架期。该研究为克服抗菌肽应用瓶颈、开发高效天然的食品防腐剂提供了新的思路和技术支持。这种基于天然聚合物的纳米递送系统具有良好的生物相容性和安全性，符合清洁标签趋势，在食品工业中具有广阔的应用前景。未来的研究可进一步关注该纳米系统的感官影响、长期稳定性以及在更复杂食品基质和体内模型中的安全性与有效性验证。
