《Nordic Journal of Botany》：Veronica paczoskiana is no more than a pine forest ecotype of V. spicata that evolved independently in forest-steppes of Ukraine and the Altai region
编辑推荐：
本研究通过基因分型测序（GBS）与孢粉形态学分析，揭示了穗花婆婆纳（Veronica spicata s.l.）复合群中松林生态型（如V. paczoskiana）在欧亚森林-草原交错带多次独立起源的进化模式。研究证实该生态型是对松林荫蔽、酸性土壤环境的平行适应，其动态演化历史与第四纪冰期-间冰期旋回中森林的进退密切相关，为理解生物在生态过渡带的适应性进化提供了典型案例。
引言
森林-草原带是受气候条件制约的生态交错带植被类型，由草原和森林群落组成的自然动态镶嵌体。其主要气候条件是水分平衡中性，即年降水量与蒸发量大致相等，并伴有干湿周期。这种中性水分平衡常见于北半球和南半球大陆性气候区。欧亚大陆的低地森林-草原从西部的潘诺尼亚盆地向东延伸至阿尔泰地区和华北，形成连续带状分布。根据孢粉谱研究，这种植被类型自上新世末和早更新世（贡兹-民德间冰期）贯穿整个更新世存在于现代西西伯利亚平原和东欧平原的森林-草原带。带状森林-草原主要由落叶树形成：欧洲森林-草原以栎树（Quercus robur）和心叶椴（Tilia cordata）为主的落叶林占优势，而在西西伯利亚则被孤立的垂枝桦（Betula pendula）林（称为“kolki”）所取代。在最干燥的地区，尤其是沙地和黄土上，欧洲赤松（Pinus sylvestris）变得更加突出。本研究以穗花婆婆纳（Veronica spicata s.l.）为例，探讨森林-草原带物种的进化历史，检验森林生态型是祖先类型，还是草原生态型是祖先类型，亦或是两者在森林-草原带中单次起源并形成邻域分布 mosaic 的假说。
材料与方法
采样、DNA提取与流式细胞术
研究收集了38份代表V. spicata及其近缘种形态多样性的材料，包括外类群V. incana、V. pinnata和V. spuria。使用innuPREP Plant DNA Kit从干燥材料（约20 mg）中提取总基因组DNA。通过凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）和TECAN infinite F200 Pro分光光度计检测DNA质量和浓度。对38份材料中的22份进行了流式细胞术倍性测定。
基因分型测序（GBS）
采用Elshire等人描述的RAD-Seq（限制性位点相关DNA测序）方案构建文库，使用对甲基化不敏感的限制性内切酶MSII。将200 ng基因组DNA用MSII酶切，连接接头，纯化后进行低循环数PCR扩增。纯化后的文库送至LGC genomics（柏林，德国）进行测序。
生物信息学
GBS原始数据存档于欧洲核苷酸档案（ENA），项目编号PRJEB86066。使用FastQC检查原始数据质量，并通过multiQC汇总结果。使用IPYRAD ver. 0.9.96流程将读数组装成基因座。参数设置包括：Phred质量分数偏移量33，序列同源性阈值85%，最大条形码错配数为0，严格过滤接头，每个基因座最大插入缺失为5，统计碱基调用最小深度为6，处理基因座的最小个体百分比为30%。
系统基因组学
使用最大似然法（IQ-TREE ver. 2.3.6）和贝叶斯推断法（MrBayes ver. 3.2.2）生成系统发育树。最大似然树在GTR+Γ+I+R模型下推断，并进行1000次超快速自举分析。贝叶斯推断使用GTR+I+Γ模型，进行两次独立运行，各1000万代，每1000代采样一次，前25%的样本作为老化期剔除。使用SplitsTree ver. 4生成邻接网络。
微形态学
研究了来自乌克兰国家植物标本馆（KW）和奥尔登堡大学植物标本馆（OLD）的26份V. spicata、V. paczoskiana和V. pseudoorchidea标本的花粉形态。花粉粒通过光学显微镜（LM）和扫描电子显微镜（SEM）进行研究。LM研究采用Erdtman的醋酸酐解法，SEM研究对干燥和醋酸酐处理的花粉粒进行喷金后观察。测量了20粒发育良好花粉粒的形态特征，包括极轴（P）、赤道直径（E）、沟和内涵孔的长度与宽度、极区直径、间沟区直径、外壁厚度等，并计算P/E比。使用PAST ver. 4.08进行UPGMA聚类分析和箱线图绘制。
特异性叶面积（SLA）
在奥尔登堡植物园温室中种植的植株上测量SLA。每个样本取十片不同大小的叶片，称重、拍照（带标尺）后，在40°C烘箱中干燥24小时再次拍照。使用ImageJ测量叶面积，SLA计算为单位叶面积的干物质量（m2kg–1）。
结果
系统基因组学
最终数据集包含5176个基因座。系统发育分析以最大支持度解析V. spicata s.l.（包括V. paczoskiana、V. pseudoorchidea和V. spicata var. viscosula）为单系群。在V. spicata内部，来自乌克兰和奥地利（潘诺尼亚类群）的样本以最大支持度聚为一支。关于森林生态型，几乎每个样本都与草原生态型亲缘关系最近，而非与其他森林生态型聚在一起。对于13个样本，在西伯利亚发生了3至5次起源和多达2次逆转，在乌克兰发生了两次起源或一次起源加一次逆转。尽管最大似然法和贝叶斯统计均高度支持主要节点，但网络分析显示出大量的网状进化关系。
微形态学
花粉粒为3（4）沟或3孔沟，形状为近扁球形到长球形（P/E = 0.82–1.75），属中小型。森林生态型的花粉粒通常小于草原V. spicata的花粉粒（平均值分别为20.74 × 18.72 μm 和 23.79 × 20.98 μm）。缺乏毛被、茎呈红色、较低的特异性叶面积（SLA）和较小的花粉似乎是这些森林生态型对荫蔽条件和更酸性土壤的平行适应。聚类分析根据花粉形态特征将样本分为两大组，一组花粉尺寸较小，另一组（包含大多数V. spicata、部分乌克兰的V. paczoskiana、V. pseudoorchidea以及一份阿尔泰地区的V. paczoskiana样本）花粉尺寸较大。按分类群分组时，V. paczoskiana和V. pseudoorchidea样本与V. spicata样本明显分开。
特异性叶面积（SLA）
特异性叶面积（SLA）在7.66至30.59 m2kg–1之间变化。V. paczoskiana样本的SLA平均仅为V. spicata样本的约50%（8.71 vs. 16.19 m2kg–1）。二倍体植株的SLA略高于四倍体植株（17.22 vs. 14.68 m2kg–1）。
讨论
V. spicata的进化历史
V. spicata是一个高度多态性的物种。本研究重点关注该群中的森林类群。在婆婆纳属（Veronica）假婆婆纳亚属（subg. Pseudolysimachium）中，大多数物种是开阔草原物种，但V. paczoskiana/V. pseudoorchidea是唯一被报道生于松林的无毛分类群或形态型。尽管存在形态差异，但分析清楚地表明，V. paczoskiana是V. spicata的一个森林生态型，显然在乌克兰多次演化形成，并在V. spicata分布区的其他部分（如西伯利亚的阿尔泰地区）也有发现。地理位置上相近的不同生境植株之间倍性没有差异。这些植株似乎是对松林环境多次响应的结果。松林与V. spicata的典型生境相比，荫蔽增加，土壤偏酸性，因此V. spicata获取养分更困难。由于过渡频繁，推测这种松林表型的改变涉及少数遗传因素。考虑到第四纪气候旋回中松林的频繁进退，这种遗传灵活性被认为具有选择优势。由于有证据表明松林在中全新世有所扩展，因此至少部分V. spicata的松林植株可能是在过去5000年内演化形成的。研究还注意到，来自松林的衍生种在植物园露天盆栽中生长时会产生一些毛。因此，认为V. pseudoorchidea是由环境诱导产生稀疏毛的松林生态型，而非Klokov假设的V. paczoskiana和V. spicata的杂交种。因此，这些松林生态型的正确分类学名称是基于变种等级优先权的V. spicata var. pseudoorchidea。
生态型特异性状
最初V. paczoskiana通过缺乏毛被、叶形和茎色与V. spicata区分。本研究表明表型分化超越这些直观特征，延伸至微形态特征。总体而言，草原生态型的花粉尺寸大于松林生态型。来自阿尔泰地区的V. paczoskiana样本的花粉大小与乌克兰的V. paczoskiana和V. pseudoorchidea大致相当。这种差异可能是个体水平对贫瘠营养条件的响应，也可能是种群水平的适应。考虑到生态型之间花的相似性以及该属广泛的传粉者谱，认为传粉者特化不是解释不同花粉大小的合理假设。在遮荫条件下温室栽培的V. spicata样本的花粉尺寸也低于平均水平。
与尺寸数据相反，孢粉形态学数据和文献记录表明，两种V. spicata的花粉粒均以3沟和3孔沟类型为特征，分类群间无差异。在所有研究样本的花粉粒中，有时观察到4沟花粉粒。数据还显示，所有V. spicata样本中，除3沟花粉粒外，还有3孔沟花粉粒。研究类群的花粉具有光滑-纳米皱状、纳米皱状、纳米皱状-穿孔状、纳米皱状-微网状和微网状的外壁雕纹，这些类群的外壁雕纹特征存在重叠。
作为第二个性状，研究了特异性叶面积（SLA），即单位叶面积的重量，是叶片稳定性的度量指标。来自森林生境的植株的SLA仅为草原植株的一半。因此，V. paczoskiana具有更稳定的叶片，单位面积干物质更多，这是干旱、贫瘠养分环境植物的典型特征。各种因素被提出，其中与光强的负相关关系被提及。然而，在本案例中可能性不大，因为森林植物的SLA更低。没有关于两种生境土壤水分的信息，以及松林是否生长在更干燥的土壤上，这也可能解释较低的SLA。因此，最可能的解释是松林酸性沙质土壤的营养匮乏导致了适应，从而形成SLA低的粗壮叶片。建议值得在不同条件下比较栽培植株，以观察哪些性状是表型可塑的，哪些是遗传的。在温室相同土壤中并排种植但SLA仍存在差异的植株表明，该性状至少在一定程度上是遗传的。因此，这些生态型可能为研究叶片稳定性生态决定因素及其遗传性提供了有用的模型。
结论
对覆盖V. spicata多样性和地理分布范围约60份样本的分析表明，森林生态型多次独立起源于典型的草原生态型（反之亦然也可能）。森林与草原生态型之间的频繁转换与更新世森林生态系统的频繁进退相平行。因此，这些森林生态型无需在变种以上等级给予分类学承认。该森林生态型的正确名称是V. spicata var. pseudoorchidea。森林生态型不仅以宏观形态特征（如无毛和窄叶）为特征，还以微形态特征（如较小的花粉和较低的SLA）为特征。目前，这些性状的适应意义仍是推测性的，但基于其他研究，松林中营养限制的影响似乎是需要研究的主要因素。所提供的花粉粒定量和定性特征及其微观形态可用于未来研究，以区分花粉谱中的两种生态型，以及生境对花粉特征的更普遍影响，而对叶片性状表型可塑性和遗传性的研究可能为了解叶片性状的进化提供重要见解。
