《Nature Communications》：EGFR inhibitor-resistant lung cancers exhibit collateral sensitivity to a covalent, cysteine-independent KEAP1 oligomerizing molecular bridge
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本研究针对EGFR突变型非小细胞肺癌(NSCLC)患者对EGFR抑制剂产生多焦点耐药的临床难题，发现耐药细胞对PAINS样小分子MCB-613产生 collateral sensitivity。研究人员通过系统蛋白质组学、功能基因组学和生物化学手段，揭示MCB-613以不依赖半胱氨酸的共价方式结合KEAP1，通过其二聚化结构域中的赖氨酸残基（K97）形成分子桥诱导KEAP1寡聚化，进而引发KEAP1功能障碍、ROS累积和ATF4/CHOP依赖性细胞死亡。该研究为克服靶向药物耐药性提供了新策略，发表于《Nature Communications》。
在精准医疗时代，靶向治疗为癌症患者带来了希望，但耐药性的出现往往使这些疗效昙花一现。以EGFR突变型非小细胞肺癌(NSCLC)为例，尽管EGFR抑制剂如吉非替尼(gefitinib)和奥希替尼(osimertinib)初期效果显著，但约24个月内大多数患者会产生耐药性。更棘手的是，肿瘤细胞可通过多种机制同时产生耐药性，导致"多焦点耐药"现象，使得联合用药策略难以实施。
面对这一挑战，科学家们将目光投向" collateral sensitivity"（附带敏感性）策略。这一思路源于微生物学研究，即耐药性本身可能使细胞对另一种药物异常敏感。在癌症研究领域，前期工作表明BRAF抑制剂耐药的黑色素瘤细胞对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂敏感，而急性髓系白血病(AML)细胞对BET溴结构域抑制剂的耐药可诱导其对BCL2抑制剂的敏感性。
发表于《Nature Communications》的这项研究，发现EGFR抑制剂耐药的肺癌细胞对一个小分子化合物MCB-613表现出显著敏感性。MCB-613是一个具有PAINS（泛筛选干扰化合物）特征的bis-chalcone类亲电化合物，此前已知可靶向类固醇受体共激活因子3(SRC-3)和泛素特异性肽酶15(USP15)。然而，本研究团队发现这些已知靶点并非MCB-613在耐药肺癌细胞中发挥作用的关键。
研究人员首先构建了包括PC9（药物敏感）及其耐药衍生物PFR3、GR4和WZR12在内的细胞模型，这些细胞分别通过IGF1R激活、EGFR T790M二次突变和MAPK1扩增等不同机制产生耐药性。通过高通量药物筛选2,100种小分子化合物，他们发现MCB-613在所有耐药细胞中均表现出显著选择性毒性，且在动物模型中也能有效抑制耐药肿瘤生长。
为阐明机制，团队合成了MCB-613的"可点击"活性衍生物ARM-3-124和非活性衍生物ARM-3-115，结合亲和纯化-质谱分析，鉴定出478个潜在相互作用蛋白。随后通过定制CRISPR/Cas9筛选，发现KEAP1（Kelch样ECH关联蛋白1）的缺失最能模拟MCB-613的表型。KEAP1是Cullin 3 E3泛素连接酶的适配体，正常情况下通过促进NRF2（核因子E2相关因子2）的泛素化降解来调控氧化应激反应。
深入机制研究表明，MCB-613通过其对称分布的两个α,β-不饱和键，以共价方式桥接两个KEAP1单体的K97残基，诱导KEAP1形成共价寡聚体。这种寡聚化不依赖于KEAP1中丰富的半胱氨酸残基（共27个），而是特异性地依赖于位于二聚化结构域的K97位点。点突变实验证实，K97A突变可完全阻断MCB-613诱导的KEAP1寡聚化和细胞毒性作用。
有趣的是，MCB-613的作用机制不依赖于经典的KEAP1-NRF2通路。尽管MCB-613处理导致NRF2积累和转录激活，但NRF2敲除不仅未挽救细胞死亡，反而增强了MCB-613的毒性。进一步研究发现，EGFR抑制剂耐药细胞基础活性氧(ROS)水平和整合应激反应(ISR)通路活性均升高，表现为ATF4（激活转录因子4）和CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）表达上调。MCB-613处理进一步加剧ROS积累和ATF4/CHOP激活，而ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和α-生育酚可逆转这一效应。重要的是，ATF4或CHOP的基因敲除可完全挽救MCB-613诱导的细胞死亡。
本研究的关键技术方法包括：高通量药物筛选（2,100种化合物）；点击化学-亲和纯化-质谱联用技术鉴定药物靶点；定制CRISPR/Cas9功能基因组筛选；蛋白质热转移分析(CETSA)；细胞热转移分析(CETSA)；以及活性位点导向蛋白质谱分析(ABPP)。研究使用了患者来源的MGH134细胞株和实验室构建的耐药细胞模型。
MCB-613诱导KEAP1寡聚化
通过免疫共沉淀和体外结合实验，研究人员证实MCB-613可直接结合KEAP1并诱导其形成高分子量寡聚体。这种寡聚体在强还原条件下依然稳定，表明其为共价交联而非二硫键连接。单边修饰的类似物ARM-143虽能与KEAP1单体共价结合，但无法诱导寡聚化，且活性显著降低，证明分子桥接机制对MCB-613功能至关重要。
分子桥接依赖KEAP1二聚化结构域
通过系统截短KEAP1的不同结构域（N末端结构域、BTB结构域、IVR结构域和Kelch结构域），发现MCB-613的活性依赖于包含K97的BTB二聚化结构域（氨基酸60-178）。精细定位将关键区域缩小至90-100氨基酸，该区域不含半胱氨酸但包含K97。计算模拟显示MCB-613可完美嵌入KEAP1表面的疏水空腔，与Arg116形成氢键，并与两个单体的K97残基形成不可逆共价键。
MCB-613通过ROS-ATF4-CHOP轴诱导细胞死亡
机制上，MCB-613通过KEAP1依赖的方式诱导ROS爆发，进而激活ATF4-CHOP信号通路。EGFR抑制剂耐药细胞基础ISR活性升高可能使其对进一步应激更敏感，达到致死阈值。KEAP1敲低可阻断MCB-613诱导的ROS产生和ATF4激活，而ATF4或CHOP敲除则消除MCB-613的毒性，证明该通路是细胞死亡的必要条件。
研究结论表明，MCB-613作为一种新型共价分子桥接剂，通过靶向KEAP1的K97残基诱导其寡聚化，进而激活ROS-ATF4-CHOP死亡轴，选择性清除EGFR抑制剂耐药的肺癌细胞。这一发现不仅揭示了KEAP1调控细胞命运的新机制，也为克服靶向药物耐药性提供了新思路。与传统的KEAP1抑制剂（主要靶向其半胱氨酸残基以解除NRF2抑制）不同，MCB-613代表了一类新型KEAP1调节剂，其作用不依赖于NRF2，而是通过分子桥接诱导KEAP1功能获得性突变，为开发"进化陷阱"式抗癌策略提供了概念验证。
该研究的重大学术意义在于：首先，提出了" collateral sensitivity"策略在肺癌治疗中的可行性，证明不同耐药机制可汇聚于共同脆弱性；其次，发现了KEAP1调控细胞死亡的非经典通路，拓展了对KEAP1功能的理解；最后，MCB-613作为首例报道的赖氨酸靶向KEAP1分子桥接剂，为开发类似药物提供了模板。尽管MCB-613本身的成药性可能受限，但其揭示的机制和靶点将为未来药物设计指明方向。
