《Biochemical Systematics and Ecology》：Discrimination of various botanical origins of
Lasiosphaera calvatia and their adulterant by chemical fingerprint, multi-component quantification, and chemometric analysis
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灵芝化学指纹鉴定与质量评价研究采用HPLC-CAD结合 chemometric 分析（CA/PCA/OPLS-DA）建立四类灵芝的鉴别方法，确定α-亚麻酸等6种特征成分含量差异，证实Calvatia lilacina与 gigantea质量较高，Bovistella sinensis为劣质冒牌品。
洪Sun|翟艳娟|李家飞|郭星宇|王家义|顾超|张玉静|李松|陈胜军|张超峰|康大立|张云天
中国药科大学教育部联合国际靶点发现与新药创新实验室，南京，211198，中国
摘要
Lasiosphaera calvatia是一种属于伞菌科（Lycoperdaceae）的大型真菌，是一种具有多种药理活性的著名中药，但其化学分类学研究相对不足。除了《中华人民共和国药典》中记载的三种官方物种：Lasiosphaera fenzlii、Calvatia gigantea和Calvatia lilacina外，市场上还存在其他相关物种和掺假品，如Bovistella sinensis，因此需要建立有效的物种鉴别方法。为此，我们开发了高效液相色谱（HPLC）指纹图谱技术，并确定了19个特征峰。结合化学计量分析（包括聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），成功区分了这四种物种。同时测定了6种成分（α-亚麻酸、亚油酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸和麦角甾醇），并认为这些成分可作为物种鉴别的特征标志物。研究结果表明：Calvatia lilacina和Calvatia gigantea的质量较高，而Bovistella sinensis的质量最低。所建立的方法具有稳定性和重复性，为该药材的质量评估和鉴定提供了依据。
引言
Lasiosphaera calvatia（LC）属于伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）和伞菌科（Lycoperdaceae），在中国广泛分布（Meng等人，2014年）。根据《中华人民共和国药典》（2025年版）的记载，其官方物种包括：Lasiosphaera fenzlii Reich.（LF）、Calvatia gigantea（Batsch ex Pers.）Lloyd（CG）和Calvatia lilacina（Mont. et Berk.）Lloyd（CL）。其传统功效包括清肺、润喉和止血。现代药理学研究表明，LC具有显著的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化和止血作用（Bu等人，2021年；Lee等人，2017年；Muszyńska等人，2018年）。
然而，市售的LC药材经常受到相关物种的污染。除了药典中规定的三种官方物种和常见掺假品外，地区性替代品如Bovistella sinensis Lloyd（BS）也常被误认为是LC。这些替代品不仅会降低治疗效果，还会给临床应用带来挑战。因此，迫切需要建立可靠的LC鉴定方法和掺假品检测方法。
目前LC的质量评估方法主要依赖于HPLC对麦角甾醇和氨基酸的测定（K?vrak等人，2014年；Xiang等人，2016年），但缺乏对多种成分的全面定性和定量分析以及指纹图谱研究。为了克服这一局限性，需要建立有效的指纹图谱和多成分定量方法。
目前，带电气溶胶检测器（CAD）作为一种通用的质量检测技术，非常适合用于吸收谱线较弱或无吸收谱线的药物化合物的定量分析。其高灵敏度和均匀的响应特性使得LC的化学成分分析更加全面，尤其适用于复杂天然产物的分析。与ELSD相比，CAD在六种指标成分的定量结果上表现更优，这得益于其更高的灵敏度和更好的响应一致性，使其成为更优的检测方法。
现有的LC物种研究主要集中在无机元素分析上（Yue等人，2021年）。虽然主成分分析（PCA）可以区分样本，但元素浓度受环境因素影响较大，与药理活性的关联较弱。在另一项研究中（Lv等人，2016年），使用红外光谱技术区分了不同地理来源的Scleroderma flavidum样本。该方法虽然能捕捉到一般的功能团谱，但在识别特定差异成分方面效果有限。此外，现有方法主要依赖无监督技术（如PCA或基于距离的判别方法，Yue等人，2021年），在复杂情况下可能缺乏足够的区分能力和稳定性。正交投影到潜在结构-判别分析（OPLS-DA）作为一种监督多变量方法，能够实现有针对性的分类，提高预测准确性和可解释性。通过计算投影中的变量重要性（VIP）得分，OPLS-DA可以量化每个变量对物种区分的贡献，从而直接识别区分LC物种的特征化合物。这为系统地发现质量标志物奠定了方法基础。
本研究建立了HPLC-CAD指纹图谱技术，并结合化学计量分析（包括层次聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），对LC进行了全面的质量评估。此外，还定量分析了不同来源的六种主要生物活性成分的含量，为该药材的来源鉴定和质量控制提供了科学依据。
仪器
色谱分析在Thermo Vanquish HPLC系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上进行，该系统配备了二元溶剂输送泵、在线真空脱气器、自动进样器和带电气溶胶检测器（CAD）。色谱数据采用Chromeleam软件（版本7.2）采集。
化学试剂
α-亚麻酸（纯度99.8%）、亚油酸（纯度99.6%）、油酸（纯度99.3%）和麦角甾醇（纯度96.2%）均购自中国
HPLC指纹图谱的建立
对CL、LF、CG和BS样品进行了指纹图谱分析，共观察到19个共同峰。CL中有15个共同峰（图2-A），LF中有14个（图2-B），CG中有18个（图2-C），BS中有16个（图2-D）。BS的7批样品之间的相似度为0.909–0.992，CL的6批样品为0.841–0.977，LF的5批样品为0.910–0.977，CG的12批样品为0.924–0.986（表1）。结果表明...
结论
本研究采用基于HPLC-CAD的多成分定量和化学计量分析方法，系统评估了LC样品的质量。结果显示，六种标志成分的含量存在显著种间差异。具体而言，CL中的棕榈酸、油酸、硬脂酸、麦角甾醇和总成分含量最高，而掺假品BS的含量明显较低。
CRediT作者贡献声明
洪Sun：撰写初稿、数据可视化、验证、软件应用、方法设计、实验设计、数据整理。
翟艳娟：资源获取、数据整理。
李家飞：实验设计。
郭星宇：软件应用、方法设计。
王家义：软件应用、方法设计。
顾超：软件应用、方法设计。
张玉静：项目管理、数据整理。
李松：项目监督、资源协调。
陈胜军：资源获取、资金争取。
张超峰：撰写修订、项目监督、项目管理。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
感谢江苏省科学技术成果转化计划的资助（项目编号：BA2021018）。
