通过协同诱导铁死亡作用将脂质纳米颗粒转化为放射性活性治疗剂，以增强癌症放射治疗效果

《Biomaterials》：Transforming Lipid Nanoparticles into Radio-Activatable Therapeutics Through Synergistic Ferroptosis for Enhanced Cancer Radiotherapy

放疗增敏纳米平台通过双重机制诱导铁依赖性凋亡并激活免疫原性细胞死亡，在4T1乳腺癌小鼠模型中有效抑制原发肿瘤和转移灶，同时增强T细胞免疫应答。

　　

申承永（Seungyong Shin）| 白佳炫（Ga-Hyun Bae）| 朴朱东（Joo Dong Park）| 科恩英（Eun-Young Koh）| 高升孝（Seunghyo Ko）| 韩济恩（Jieun Han）| 朴春冠（Chun Gown Park）| 金东贤（Dong-Hyun Kim）| 南坤（Kun Na）| 朴伍兰（Wooram Park）

韩国成均馆大学（Sungkyunkwan University, SKKU）生物技术与生物工程学院综合生物技术系，地址：Seobu-ro 2066, Suwon, Gyeonggi 16419

摘要

放射治疗（RT）是癌症治疗的基石，但其疗效常常受到强效抗氧化防御机制的干扰，这些机制会抵消辐射引起的氧化应激。在这项研究中，我们开发了一种新型的双重作用纳米平台——放射激活脂质纳米颗粒（RaLNPs），旨在通过增强辐射诱导的铁死亡（ferroptosis）来提高放射敏感性。RaLNPs同时包含了靶向谷胱甘肽过氧化物酶4（siGPX4）的siRNA（siGPX4是一种关键的铁死亡防御抗氧化酶）和7-脱氢胆固醇（7-DHC，一种对辐射有反应的脂质）。值得注意的是，传统的胆固醇被7-DHC完全取代，从而使这种载体本身具备由辐射激活的治疗功能。工程化的RaLNPs通过抑制GPX4的表达来破坏铁死亡防御系统，并在受到辐射时放大7-DHC介导的自由基链反应，从而发挥双重作用。重要的是，在没有辐射的情况下，RaLNPs不会引起氧化应激或铁死亡；而治疗性辐射则能选择性地触发强效且依赖铁的铁死亡。除了直接杀死肿瘤细胞外，这种铁死亡过程还引发了典型的免疫原性细胞死亡（ICD）特征，表现为ATP释放、钙网蛋白暴露和HMGB1释放。在4T1乳腺癌小鼠同基因模型中，RaLNPs与单次辐射联合使用显著抑制了原发肿瘤的生长，并减少了转移病灶，且没有全身毒性。肿瘤组织分析表明，这种治疗效果是由协调的免疫反应驱动的，这种反应将肿瘤引流淋巴结中的T细胞激活与功能性细胞毒性T淋巴细胞的持续浸润联系起来。总之，本研究开发的RaLNPs是一种创新的放射激活增敏剂，能够在辐射作用下同时诱导肿瘤细胞死亡和抗肿瘤免疫。这项工作展示了一种转化策略，即将传统的纳米颗粒载体发展为具有主动治疗作用的物质，以克服放射治疗的局限性。

引言

放射治疗（RT）被应用于大约50%的癌症患者中，是局部肿瘤控制的基石[1]。它利用高能电离辐射诱导细胞死亡，要么直接通过损伤癌细胞的DNA，要么通过水分子的辐射分解产生大量活性氧（ROS）[2]来实现。然而，其治疗效果仍受到根本性限制，包括由于非选择性作用对周围正常组织的损伤以及肿瘤的固有或获得性放射抵抗[3]。为了克服这些限制，人们积极研究开发能够选择性增强肿瘤放射敏感性的增敏剂[4][5][6]。然而，传统的基于纳米颗粒的方法在安全性和临床转化方面存在局限性，通常仅作为被动载体使用，这不足以有效克服肿瘤的复杂放射抵抗机制[7][8]。

铁死亡是一种新型的调控性细胞死亡形式，其特征是依赖铁的脂质过氧化，正成为克服传统疗法耐药性癌症的新选择[9]。铁死亡独立于传统的细胞死亡机制——凋亡发生，研究表明辐射本身可以通过产生ROS来诱导铁死亡[10]。然而，癌细胞常常通过强效的抗氧化防御系统来抵消这种效应，因此单独使用辐射诱导的铁死亡往往不足以产生治疗效果[11]。因此，人工放大这一机制的策略正受到关注，被视为克服放射抵抗的关键方法[12][13]。特别是，铁死亡受到细胞抗氧化防御系统的强烈抑制，尤其是谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的抑制，阻断GPX4的功能被认为是诱导铁死亡的最直接方法之一[14][15][16]。

在这项研究中，我们提出了一种双重作用策略来通过辐射放大铁死亡效应。第一种策略是使用siRNA直接抑制GPX4的表达，这是一种关键的铁死亡防御酶[17]。第二种策略利用7-脱氢胆固醇（7-DHC，胆固醇的生物合成前体）作为新型的放射响应性增敏剂[18]。由于7-DHC的B环中含有二烯结构，它具有独特的化学性质，能够与辐射产生的初始ROS反应，从而引发自由基链反应[19][20]。

为了有效实施这一双重策略，我们对临床验证过的脂质纳米颗粒（LNPs）进行了根本性的重新设计。在本研究中，主要的结构脂质胆固醇被具有治疗活性的7-DHC完全取代。这一结构创新不仅使得疏水性7-DHC能够在不使用有毒有机溶剂的情况下实现生物相容性递送，还将LNPs从仅仅封装和递送货物的被动载体转变为在辐射作用下直接参与治疗的主动治疗剂。

因此，我们的核心假设是：负载siGPX4的7-DHC基LNPs将通过抑制GPX4来破坏癌细胞的铁死亡防御机制，并在受到辐射时通过7-DHC放大脂质过氧化，从而诱导协同的铁死亡。关键在于，该系统在无辐射的情况下保持生物惰性，确保高治疗选择性。此外，我们还探讨了这种强烈的铁死亡诱导是否能够触发免疫原性细胞死亡（ICD），并弥合局部肿瘤控制与全身抗肿瘤免疫之间的差距。最终，这项研究展示了一种转化方法，将传统的LNPs从被动载体发展为具有主动治疗作用的物质，以增强局部肿瘤控制并调节抗肿瘤免疫反应，从而提供一种提高癌症放射治疗效果的有效策略。

7-DHC含量LNPs的制备与优化

本研究的核心是通过将结构脂质胆固醇替换为放射响应分子7-DHC，赋予LNPs本身治疗功能。为此，我们进行了筛选，以确定一种能够在保持LNPs物理化学性质和基因递送功能的同时稳定掺入7-DHC的最佳配方。

结论

在这项研究中，我们开发了一种放射激活脂质纳米颗粒（RaLNP）平台，通过将纳米载体本身转变为具有主动治疗作用的成分来提高放射治疗的效果。通过用放射响应性固醇7-DHC替代传统的胆固醇，并共同递送siGPX4，RaLNPs在结构脂质完全替代的情况下仍保持了物理化学稳定性、高核酸封装效率和有效的细胞质递送能力。

材料

DLin-MC3-DMA（MC3）和JC-1购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 Junction）。胆固醇、7-DHC、乙醇、噻唑蓝四唑溴化物（MTT）、结晶紫和2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）购自Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴斯特）。负对照siRNA

CRediT作者贡献声明

朴朱东（Joo Dong Park）：软件、方法学、实验设计、数据分析。科恩英（Eun-Young Koh）：数据可视化、软件使用、实验设计、数据分析。高升孝（Seunghyo Ko）：实验设计、数据分析、数据管理。韩济恩（Jieun Han）：项目监督、资源协调、项目管理。申承永（Seungyong Shin）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、资源管理、实验设计、数据分析、概念构思。白佳炫（Ga-Hyun Bae）：撰写——

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者提出合理请求后获取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

申承永（S. Shin）和白佳炫（G.-H. Bae）作为共同第一作者对这项工作做出了同等贡献。我们感谢Seokhee Lee在修订过程中提供的额外实验帮助。插图使用BioRender.com软件制作。本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（由韩国政府科学部与信息通信技术部（MSIT）提供资金，项目编号RS-2024-00350878和RS-2023-00242443），以及NRF支持的生物与医疗技术开发计划的支持。