《Biomass and Bioenergy》：RSM-ANN sequential optimization of biomass, lipid yield, and biodiesel quality from
Chlorella
salina
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盐生微藻（Chlorella salina）通过响应面法（RSM）与人工神经网络（ANN）联合优化N?、NaHCO?和CO?条件，显著提升生物量（312 mg/L）和油脂含量（26.11%），确定最佳培养时间为27天，为可持续生物柴油生产提供新策略。
Mohamed A. Hassaan | Nesma I.M. Abdelaziz | Murat Y?lmaz | Ahmed M. Ibrahim | Mohammed S. Hassouna | Ahmed El Nemr
环境部门，国家海洋学与渔业研究所（NIOF），Kayet Bey，Elanfoushy，亚历山大，埃及
摘要
对可持续生物燃料的迫切需求，这些燃料不会危及粮食安全，这加剧了优化盐生小球藻（Chlorella salina，简称C. salina）用于生物质和脂质生产的努力。本研究采用了一种顺序实验-建模方法，结合响应面方法（RSM）和人工神经网络（ANN）进行验证，以优化影响生物质、脂质产量和生物柴油特性的生长参数。在F/2培养基中培养时，C. salina在第9天进入稳态阶段，12天后细胞密度达到5.39 × 10^6个细胞/毫升，生物量产量峰值达到312毫克/升。在相同条件下，12天后记录到最高的脂质含量（26.11%）和产量（6.79毫克/升·天）。气相色谱分析显示饱和脂肪酸（SFA）占44.04%，而基础SAG培养基则产生最多的单不饱和脂肪酸（MUFA，36.73%）和多不饱和脂肪酸（PUFA，18.23%）。RSM模型表现出出色的预测能力（R^2 > 0.97），这一点得到了ANN的证实，ANN与实验数据高度吻合。通过期望函数的多响应优化确定了最佳条件：培养27天，N2浓度为800 ppm，NaHCO3浓度为100 ppm，CO2浓度为13 ppm。这种验证过的顺序策略为优化复杂的生物系统提供了一个稳健的框架，提高了藻类生物燃料的经济可行性。
引言
工业化的快速发展和全球机动车使用的增加显著提高了对石油衍生燃料的需求。目前，世界约80%的总能源需求通过化石燃料的消耗来满足。然而，这些燃料的燃烧是温室气体（GHG）排放的主要来源，进而引发了包括全球变暖、冰川退缩、海平面上升、生物多样性丧失以及各种疾病发病率增加等一系列环境问题[1]。国际原油价格的持续上涨对世界经济产生了深远影响。因此，迫切需要转向绿色、可再生、可持续且经济可行的能源[2]。在各种替代方案中，生物燃料被认为是最有前景且对环境最友好的选择之一。它们的可再生性和生物降解性使其成为替代传统化石燃料的理想候选者[3]。
生物燃料通常分为两大类：初级生物燃料和二级生物燃料。二级生物燃料，如生物乙醇和生物柴油，由生物质制成，适用于交通运输和各种工业应用。根据加工技术、原料类型和技术进步阶段的不同，二级生物燃料进一步分为第一代、第二代和第三代生物燃料[4]。第一代生物燃料主要来源于食品基材料，包括植物油和动物脂肪[4]。与第一代生物燃料相关的可持续性挑战促使了第二代生物燃料的发展，这些生物燃料由木质纤维素材料、农业废弃物、草类和城市固体废物制成[5,6]。
第三代生物燃料主要来源于微生物，如酵母、真菌和微藻，用于生产油脂[7,8]。其中，微藻衍生的生物燃料被认为是比第一代和第二代生物燃料更高效和优越的替代品[9]。微藻作为第三代生物燃料的生产原料具有多个关键优势：（1）适应多种环境条件；（2）具有较高的养分和废水吸收能力；（3）能有效吸收二氧化碳等废气[[10], [11], [12], [13]]。从微藻合成的生物柴油是“绿色能源”的一个显著例子，具有快速生长潜力、较低的环境影响，并有助于减轻城市空气污染[[14], [15], [16], [17], [18]]。尽管旨在节约能源和减少排放的策略（如在源头捕获废气和处理废水）有效减少了环境污染，但利用在废气和废水中培养的微藻生产生物柴油进一步提高了废物管理效率[19]。作为一种清洁、可再生和可持续的能源，生物柴油被广泛认为是传统化石燃料的有希望的替代品，应得到更广泛的应用[20,21]。
Bhola等人[22]和其他人的研究表明，微藻在固碳方面发挥着关键作用。同样，Singh[23]和其他几位研究人员也报告称，微藻能够有效净化废气并增强碳固定能力。Xueqing等人[24]还观察到，微藻能够有效处理受抗生素污染的废水。尽管取得了这些进展，但关于利用光生物反应器中培养的微藻生产生物柴油的废物材料的研究仍然有限。尽管Zhizhan等人[25]研究了微藻-细菌联合体在废水处理中的应用，但大多数现有研究仍然集中在评估微藻对废气和废水修复的影响上。同时，对整个系统性能的全面评估仍然很少。
技术预测表明，微藻有可能成为第三代生物燃料生产的主要原料。从微藻中提取的生物柴油代表了可持续能源发展的最有前途的方向之一。培养微藻可以高效利用烟气中的二氧化碳，并从废水中去除氮和磷[[26], [27], [28], [29]]，从而支持生物柴油的生产，同时减轻环境污染。目前，大规模微藻生物柴油生产主要依赖于开放式池塘系统；然而，这种方法受到藻类生长速度相对较慢的限制。
响应面方法（RSM）通过多元回归和相关性分析，在复杂的多变量过程中建立多个输入变量与响应之间的实际关系[30]。它使用比传统方法更少的试验次数，就能评估自变量对因变量的影响，并获得统计上显著的结果[31]。RSM已经优化了从粗废煎炸油[32]、使用过的食用油[33]和盐生小球藻（Chlorella salina）生物质[34]等原料生产生物柴油的过程。生物柴油合成涉及可再生脂质（植物油、动物脂肪、微藻脂质、回收油脂）与酒精和催化剂的酯交换反应，高效的催化可以提高反应速率和产量[32]。Chlorella属微藻能够适应多种环境，并迅速积累超过20%的干生物质脂质，使其成为有前景的生物柴油原料。然而，要实现高生物量和脂质产量，需要优化的培养策略、菌株选择和工艺设计。
C. salina》独特地合成了易于转化为高质量生物柴油的液态烃。然而，由于营养物、碳源、pH值、光照和时间等相互作用变量的存在，将其实验室成果工业化放大仍面临挑战[34]。
本研究通过优化培养条件、生长动力学（细胞计数和光密度）和生物质参数，来提高C. salina的脂质积累和生长。RSM和ANN评估了三个关键参数（N2水平、NaHCO3浓度和CO2可用性），以优化生物柴油生产的脂质生产和生长条件。传统的一次一个因素（OFAT）方法效率低下，无法有效考虑参数之间的相互作用，导致结果不理想。我们的顺序实验设计克服了这一问题：首先通过筛选确定关键因素，然后使用中心复合设计（CCD）的RSM绘制响应曲线。为了验证假设，使用相同数据训练了一个ANN（数据驱动工具），以便比较RSM和ANN的预测能力。期望函数随后共同优化了多个指标，以提高C. salina的生产力。这是首次将顺序RSM-ANN与C. salina的综合生长-脂质-生物柴油分析相结合，提供了一个能够捕捉非线性协同效应的混合建模框架，以实现可扩展的、粮食安全的生物燃料生产。
材料与方法
实验使用了盐生小球藻（Chlorella salina）（图1）。C. salina样本来自埃及亚历山大的国家海洋学与渔业研究所。培养是在按照已知文献[34]用天然海水配制的F/2培养基中进行的。所有化学品均直接从美国Aldrich公司购买，无需进一步纯化。所有实验均进行了重复，标准偏差≤ ±2.7%。
生长测量
许多研究使用F/2培养基来培养C. salina[40]。Indrayani等人[40]评估了新分离的C. salina菌株UNM-IND1在不同培养条件下的生长和产量，比较了F/2、Walne、Jaworski和NPK + 尿素培养基在不同光照强度下的表现[40]。Pasquini等人[41]研究了营养源对Ulva菌株的生化组成、生长、品质和适口性的影响，使用了富集F/2的泻湖水培养基。
结论
C. salina》由于其在高培养条件下的高生物量和脂质产量，成为生物柴油生产的有希望的来源。本研究表明，通过改变氮、碳酸氢钠和二氧化碳的水平可以调节海洋微藻中的脂质含量。营养物质的可用性不仅提高了生物量产量，还能促进藻细胞内的脂质积累。
CRediT作者贡献声明
Mohamed A. Hassaan：撰写初稿、验证、软件开发、调查、数据分析。
Nesma I.M. Abdelaziz：验证、方法论设计、数据分析、概念化。
Murat Y?lmaz：撰写初稿、验证。
Ahmed M. Ibrahim：撰写初稿、软件开发。
Mohammed S. Hassouna：监督、概念化。
Ahmed El Nemr：审稿与编辑、监督、数据分析、概念化。
资助
本研究未接受任何外部资助。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
