由LAB酵母联合体产生的细胞外活性氧物质：一种可持续降解水中细胞外抗生素抗性基因的策略

《Bioresource Technology》：Extracellular reactive oxygen species generated by LAB-yeast consortium: A sustainable strategy for degrading extracellular antibiotic resistance genes in water

外源抗生素抗性基因降解效率达3.24log，LAB-酵母共生体通过胞外H2O2氧化实现高效去除，EPS介导吸附与氧化协同作用克服传质限制，适用于复杂水体。

　　

卢东|李鹏程|夏国辉|张欣|薛梦珠|王克宁|刘鹏|李丽萍|刘新辉

北京师范大学环境学院水环境模拟国家重点实验室，中国北京100875

摘要

胞外抗生素抗性基因（eARGs）在环境中的传播是一个持续的治理挑战。虽然生物策略通常依赖于细胞内的酶促降解，但微生物驱动的胞外化学氧化的潜力仍被大大低估了。本研究探讨了一种乳酸菌（LAB）-酵母联盟，该联盟能够生成胞外活性氧（ROS）来降解eARGs，而无需添加外源化学物质。在优化条件下（溶解氧=4.5 mg L^?1，Mn²⁺ = 50 mg L^?1），该联盟积累了高达0.63 mg L^?1的胞外H₂O₂。这种自维持的氧化系统实现了对质粒携带的Chl基因3.2log的去除。通过使用清除剂淬灭和无细胞滤液进行的机制研究表明，胞外H₂O₂是主要的氧化剂。关键的是，胞外多糖（EPS）创造了一个反应性微环境，促进了微生物驱动的胞外化学氧化，将可逆吸附转化为永久性的氧化降解。与受细胞内摄取限制的传统生物方法不同，这种胞外氧化策略克服了质量传递障碍，达到了与高级氧化过程相当的去除效率。尽管基质氧化剂的需求降低了效率，该系统在河流和水产养殖水中仍保持了1–2 log的基因减少。这项工作阐明了一种由微生物胞外ROS驱动的新的吸附-氧化协同作用，为减轻水环境中的eARGs提供了一种绿色、可持续的策略。

引言

抗生素抗性基因（ARGs）的传播构成了一个严重的全球健康威胁（Murray等人，2022年）。虽然细胞内的ARGs局限于宿主细胞内，但通过细菌裂解或分泌释放的胞外ARGs（eARGs）在水环境中以10⁵至10⁸拷贝/mL的浓度存在（Miao等人，2025年）。这些eARGs由于能够转化具有抗性的细菌，从而加速了抗性的水平转移，代表了重大的生态风险。目前减轻ARGs的策略通常分为生物和化学两类，但两者都面临关键的限制。生物处理方法，如膜生物反应器（MBRs）和传统活性污泥（CAS）系统，通常只能实现0.6–3.8 log的ARGs减少（Kappell等人，2018年；Zhao等人，2019年；Zieliński等人，2021年）。然而，这些过程主要依赖于细胞内降解或物理吸附（Chen等人，2019年）。传统生物处理的一个根本性但常被忽视的限制是污染物与降解剂之间的空间不匹配。大多数生物去除机制依赖于细胞内的酶促代谢，污染物必须首先穿过细胞膜才能接触到位于细胞质或周质中的分解酶（例如核酸酶或水解酶）（Fadare和Okoh，2021年）。然而，eARGs是高分子量的亲水分子，这阻止了它们通过细菌细胞膜的疏水性磷脂双层被动扩散（Nielsen，1998年）。因此，eARGs的降解受到质量传递限制的严重制约，特别是DNA摄取效率低下（Mao等人，2015年）。虽然细菌可以通过自然转化摄取eDNA，但这一过程受到严格调控，需要能量，并且仅限于在特定生理状态下的少数“具有抗性”的细胞。结果，大量的细胞内酶与大部分eARGs物理隔离，使其对这种外部抗性库无效。这种隔离屏障使得eARGs即使在生物活性系统中也能持续存在并吸附在污泥絮体上（Uluseker等人，2021年）。因此，eARGs往往只是转移到污泥中并被保留下来，而不是被结构破坏，可能会促进其长期存在或重新释放到环境中（Zhou等人，2019年）。相比之下，高级氧化过程（AOPs）（例如Fenton、臭氧氧化）能有效破坏细胞膜并通过活性物质使DNA矿化（Zhang等人，2020年；Zheng等人，2023年）。尽管这些物理化学干预措施非常高效，但通常需要苛刻的反应条件（例如极端pH值、连续化学投加或高能辐照），并且存在产生有毒副产品的风险（Destiani和Templeton，2019年）。这种二分法突显了迫切需要温和的、生物相容的氧化途径，能够在不产生生态负面影响的情况下实现化学氧化的破坏效果。微生物驱动的胞外氧化代表了一个有前景的前沿，可以填补这一空白。与被动生物吸附不同，这种机制利用特定微生物在环境条件下生成胞外活性氧（ROS）的固有代谢能力。例如，海洋细菌Roseobacter属生成胞外超氧阴离子（O₂^·-）来驱动锰的氧化（Hansel等人，2015年），而Pseudomonas aeruginosa利用胞外NADPH氧化酶产生ROS来降解污染物（Stenuit等人，2009年）。这些生物生成的ROS流在微生物-基质界面促进了元素循环和有机物的转化（Sutherland等人，2020年）。尽管如此，利用这种暗色生物ROS直接降解eARGs的潜力尚未得到系统研究（见表1和2）。

乳酸菌（LAB）具有独特的代谢特性，使其特别适合这一应用。LAB普遍存在于废水和水环境中，在有氧条件下利用黄素依赖的氧化酶将分子氧还原为过氧化氢（H₂O₂）（Fidan等人，2022年；Hertzberger等人，2014年）。与许多能迅速解毒ROS的好氧菌不同，LAB通常缺乏功能性过氧化氢酶和血红素过氧化物酶，从而使H₂O₂在细胞外积累到功能性相关浓度（0.02–0.65 mg L^?1）（Adesokan等人，2010年；Enitan等人，2011年）。这一代谢特性理论上创造了一个能够攻击eARGs的自维持氧化微环境。然而，纯LAB培养的应用常常受到氧化自抑制和环境适应性的限制。为了解决这个问题，我们利用了在发酵食品生态系统中广泛观察到的LAB和酵母之间的强大互惠相互作用。文献表明Saccharomyces cerevisiae通过分泌必需的营养物质（特别是氨基酸）积极调节代谢生态位，这对维持LAB的存活和代谢通量至关重要（Ponomarova等人，2017年；Viljoen，2006年）。此外，共培养促进了混合物种生物膜的发展。这种空间组织在复杂社区中作为一种竞争策略，显著增强了LAB的生物量和环境适应性，相比浮游单培养（Fan等人，2020年）。通过利用互惠相互作用，LAB-酵母联盟减轻了氧化应力并维持了胞外ROS的生成，从而显著提高了eARGs的治理效率。

为了弥合生物安全性和氧化效率之间的差距，我们提出了这种新的微生物驱动的胞外化学氧化策略。与被动生物衰减和能量密集型非生物AOPs不同，LAB-酵母联盟建立了一个独特的、自维持的生态位。它利用原位ROS生成，有效地将生物技术的可持续性与化学氧化的强烈降解动力学结合起来。在这项研究中，我们使用了一种包含LAB和酵母的商业益生菌配方作为模型联盟，以建立一个生物胞外氧化系统。本研究旨在：（1）确定最大化胞外H₂O₂生成的物理化学驱动因素；（2）量化这种生物氧化剂驱动的eARG降解的动力学；（3）使用清除剂淬灭和替代试验阐明胞外多糖（EPS）介导的吸附和H₂O₂介导的氧化之间的协同机制。这项工作展示了一种新的生物氧化途径，强调了微生物胞外ROS作为对抗抗生素抗性传播的可持续屏障的作用。

部分摘录

微生物联盟和目标质粒

本研究中使用的微生物联盟是一种原本用于水产养殖应用的商业益生菌配方。为了明确表征社区组成，进行了16S rRNA基因和ITS区域扩增子测序。真菌成分被确定为Saccharomyces cerevisiae。细菌社区主要由LAB组成，其中最丰富的属是Lentilactobacillus（77.40％），其次是Lactobacillus kitasatonis（8.52％）

社区组成和营养因素对胞外ROS生成的调节

联盟内的代谢相互作用对于最大化胞外H₂O₂的积累至关重要。虽然从混合物中分离出的五种单独的LAB物种仍具有生成H₂O₂的能力，但它们的稳态浓度（0.05–0.08 mg L^?1）显著低于原始联盟的浓度（0.22 mg L^?1）（图1a）。这表明混合社区支持比单培养更高的氧化通量。

结论

本研究建立了一个共生的LAB-酵母联盟，作为用于eARG降解的自维持胞外氧化系统。该联盟通过一种协同的“捕获-消除”机制实现了3.24log的去除效率，其中EPS介导的物理捕获与微生物驱动的胞外化学氧化（胞外H₂O₂：0.63 mg L^?1）相结合，导致DNA不可逆的断裂。这一过程有效地克服了传统生物方法的质量传递限制

未引用的参考文献

Bader等人，1988年；Chen等人，2015年；Hansel和Diaz，2021年；Ovis-Sánchez等人，2023年；Wang，2008年；Yoon等人，2021年。

CRediT作者贡献声明

卢东：撰写——原始草稿，方法论。李鹏程：方法论，研究。夏国辉：方法论。张欣：研究。薛梦珠：数据管理。王克宁：正式分析。刘鹏：方法论。李丽萍：监督，正式分析。刘新辉：撰写——审阅与编辑，项目管理，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

该项目得到了山东省重大科学技术创新项目（编号2021CXGC011201）、中国国家重点研发项目（编号2021YFC3101700）以及北京师范大学珠海市重大科研项目补充资金（编号ZHPT2023001）的支持。