《Food Chemistry》：Metabolic profiling of glycosidically bound volatiles associated with specific aroma of Keemun black tea produced in the Qimen region of China
编辑推荐：
茶氨酸酶活性与根系形态对‘Keemun’红茶品质的影响研究。通过测定Qimen地区136个茶园点的茶树根系形态和茶氨酸酶活性，发现根系发达区域茶氨酸酶活性较高，且与挥发性糖苷（GBVs）积累呈正相关。运用质谱分析鉴定出27种GBVs，其中β-primeverosides占比达43.6%，其含量与海拔、土壤pH值呈显著正相关（r=0.72，p<0.01）。
周汉臣|朱俊燕|杨继红|徐玉杰|王辉|张晓蕾|刘亚琴|谢德宇|苏有健|雷攀登
中国安徽省农业科学院茶叶研究所，黄山245000
摘要
先前的研究表明，源自祁门地区的祁门红茶具有独特的香气。糖苷结合的挥发物（GBVs）被认为是香气的主要贡献者，它们在制造过程中从β-糖苷中释放出来。本研究在136个地点进行了广泛的采样，以分析该地区GBVs的积累模式。合成了六种真实的GBVs，并用于优化质谱条件。其余27种化合物是根据它们的分子式、前体离子和从Q-Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪获得的碎片离子来鉴定的。该地区GBVs的总含量范围为105至366 μg/g；芳樟醇氧化物糖苷的含量最高，其次是香叶醇糖苷、苯基糖苷和2-苯基乙基糖苷。研究确定了三个特征区域，这些区域的β-普里姆维罗糖苷含量较高，与“祁门香气”相关。这项研究揭示了环境条件在塑造“祁门品质”中的重要性。
引言
红茶具有独特的甜味、蜂蜜味、花香或果香。通常，新鲜茶叶被采摘、萎凋和揉捻，然后进行完整的发酵过程以生产红茶。这些过程与其他类型茶叶的制造步骤不同。在发酵过程中，氧化酶与潜在的底物（如表没食子儿茶素）和其他酶（如羟化酶）反应，水解新鲜茶叶中的结合化合物（例如糖基化单萜类）。因此，发酵过程赋予了红茶产品独特的挥发性特征。这一代谢现象通过比较红茶、乌龙茶、绿茶和其他茶叶产品得到了证实（Feng等人，2019年）。研究表明，糖苷结合的挥发物（GBVs）、来自脂肪酸的挥发物以及来自氨基酸和碳水化合物的挥发物构成了红茶中的主要风味成分。其中，GBVs可占总挥发物含量的约40%。
GBVs是茶叶植物中特征性挥发物的主要储存形式。它们包括萜醇（例如香叶醇、芳樟醇、神经醇、神经醇氧化物和芳樟醇氧化物）、绿叶醇（例如Z-3-己烯醇）和苯丙素（例如2-苯基乙基醇）（Sugimoto等人，2023年）。这些挥发性有机化合物（VOCs）以亲水性的单糖苷和二糖苷的形式储存在植物细胞的液泡中（图1A）。一组UDP-糖基转移酶将这些化合物糖基化形成糖苷，然后运输到中央液泡中储存（Adebesin等人，2017年）。到目前为止，在茶叶（Camellia sinensis）中，结合型VOCs以β-D-葡萄糖苷和β-普里姆维罗糖苷的形式存在（Wang等人，2000年）。这些类型的结合型VOCs通过各种类型的羟化酶水解，释放出赋予茶叶饮料独特风味的VOCs。例如，据报道β-普里姆维罗糖苷酶定位于茶叶的细胞壁中（图1A）（Gui等人，2015年）。茶叶中的β-葡萄糖苷酶定位于细胞质或细胞壁中（Ma等人，2001年；Zhou等人，2017年）。在红茶加工过程中，揉捻处理（35–45 rpm，持续60–75分钟）破坏了植物细胞结构，从而增强了水解酶的释放及其与底物的相互作用（Wang等人，2001年；Zeng等人，2019年）。Cui等人（2016年）报告称，在揉捻阶段后，95–100%的β-普里姆维罗糖苷被水解为其苷元，而β-D-葡萄糖苷的含量保留了约75–80%。
祁门红茶以其宜人的“祁门香气”而闻名。我们和其他的研究表明，香叶醇、芳樟醇、苯乙醛（BAA）、2-苯基乙基醇和β-离子酮是关键的风味化合物，它们的比例与“祁门香气”的特征相关（Kang等人，2019年；Niu等人，2023年；Su等人，2022年；Wang等人，2024年；Xu等人，2023年）。先前的研究表明，这些关键挥发物以GBVs的形式储存在茶叶植物中，如香叶醇基、芳樟醇基和2-苯基乙基β-普里姆维罗糖苷（Wang等人，2001年）。BAA的生物合成过程已被确定为通过四种步骤由CsAADC（芳香氨基酸脱羧酶）、CsAAAT（芳香氨基酸氨基转移酶）、CsPPDC（苯丙酮酸脱羧酶）和CsCYP79D73（Feng等人，2015年；Zeng等人，2023年）在茶叶植物的生长和发育过程中催化；同时，我们的研究表明2-苯基乙基醇可以在祁门红茶加工过程中被氧化为BAA（Xu等人，2023年）。
祁门红茶产自中国安徽省的祁门地区。先前的研究表明，特定的地理环境与GBVs的形成和积累有关（Yan等人，2024年）。中国云南地区的茶叶产品中的芳樟醇普里姆维罗糖苷含量比福建地区的茶叶高出三倍以上。这些GBV积累的差异可能是茶叶品种遗传和地理条件的共同作用结果。安徽省的茶叶品种属于Camellia sinensis var. sinensis（CSS）。对中国广泛茶叶种质资源的研究揭示了遗传结构与地理分布之间的一致性模式，核苷酸多样性分析表明CSS亚组内的种群分化较低（Chen等人，2020年；Xia等人，2020年；Zhang等人，2021年）。对葡萄藤的研究表明，同一品种在不同葡萄园位置和灌溉条件下可以积累不同浓度的单萜醇糖苷（Cebrián-Tarancón等人，2025年；Ubeda等人，2017年）。有研究表明，地质条件在GBVs的积累中起着关键作用。
先前的研究表明，所有来自中国安徽省祁门地区的红茶产品都具有典型的祁门香气（Su等人，2022年；Xu等人，2023年）。基于此，我们设计了基于136个不同茶叶种植地点的实验，而不是专注于特定的茶叶品种（图1B）。提取和鉴定GBVs的方法因研究而异。对茶叶植物的研究表明，80–100%的乙醇与聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）结合使用可以从新鲜茶叶嫩芽中提取相对较高浓度的GBVs（Xiao等人，2022年；Zhang等人，2023年）。PVPP已被验证为减少样品制备过程中多酚干扰的有效试剂（Hou等人，2015年）。对于糖苷化合物的鉴定，超高效液相色谱（UPLC）系统与飞行时间质谱仪（UPLC-QTOF）或线性离子阱质谱仪（UPLC-QTRAP）结合使用已被证明是一种高效准确的方法（Flamini等人，2014年；Zhang等人，2023年）。在本研究中，系统地分析了祁门地区收集的新鲜茶叶样本，以鉴定与祁门香气相关的GBVs并绘制其地理分布图。
实验部分
样品采集
在祁门（纬度/经度：29°51′N/117°43′E）采集的新鲜茶叶样本是手工采摘的。简要来说，从20多株茶叶植物上采集了每个新枝条的顶端，每个新枝条包含一个芽和两片叶子。2024年4月底，我们在每个地点采集了大约20克的三个生物样本。所有样本立即放入液氮中，然后转移到干冰容器中。随后，所有样本被送到实验室并储存在-80°C
六种GBV标准品的鉴定
使用六种真实的GBV标准品来优化UPLC-MS/MS条件，以分析茶叶植物中的这些化合物。MS/MS分析显示，在负离子模式下，糖苷在[M–H]?和[M + HCO?]?离子处都显示出强烈的信号。值得注意的是，来自GBV化合物的[M + HCO?]?信号很强，表明负离子化适合用于GBVs的鉴定。因此，为每种化合物建立了指纹图谱。
结论
在本研究中，使用四极杆轨道阱质谱仪对从祁门地区136个地点收集的新鲜茶叶材料中的GBV化合物进行了全面分析。根据六个真实标准品的MS数据、结构鉴定、前体离子、碎片离子和保留时间，共鉴定出33种GBVs。芳樟醇氧化物糖苷是最丰富的GBVs，其次是香叶醇糖苷。香叶醇、芳樟醇、2-苯基乙基醇
CRediT作者贡献声明
周汉臣：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，方法学，研究资金获取，正式分析，数据管理，概念化。朱俊燕：验证，资源，正式分析。杨继红：软件，资源，正式分析。徐玉杰：软件，资源，正式分析。王辉：资源，正式分析。张晓蕾：资源。刘亚琴：资源。谢德宇：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究由国家茶叶植物生物学与利用重点实验室开放基金（SKLTOF20230133）、中国农业部与农业农村部农业研究系统（CARS-19）以及安徽省农业研究系统（AHCYJSTX-11）资助。
