针对新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）的Prp8 Intein靶向小分子抑制剂的设计、合成及抗真菌活性评估

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, and antifungal evaluation of Prp8 Intein-targeting small molecule inhibitors against Cryptococcus neoformans

本研究以Prp8 intein抑制剂6G-318S为lead化合物，合成了系列1,2,3-噻二唑衍生物，发现化合物B5对新生隐球菌和格氏隐球菌的体外MIC分别为1.0和0.5 μg/mL，且水溶性提升57倍，体内疗效显著，为新型抗真菌药物开发提供候选分子。

　　

英涛|林旺|黄行胜|方文|谭晓琴|朱一云|孙建汉|万新燕|田秀云|郭婷|周伟|廖国建

中国西南大学药学院，重庆400715

摘要

新型隐球菌被归类为真菌中的关键优先病原体，这突显了迫切需要安全有效的新型抗真菌药物。病原真菌中Prp8蛋白独特的intein自剪接过程使得Prp8 intein成为了一个有吸引力的抗真菌靶点。以Prp8 intein抑制剂6G-318S为先导化合物，设计并合成了一系列1,2,3-噻二唑衍生物。其中，化合物B5对新型隐球菌（MIC = 1.0 μg/mL）和加蒂隐球菌（MIC = 0.5 μg/mL）表现出优异的体外抗真菌活性。值得注意的是，与6G-318S相比，B5的水溶性提高了57倍，并且在动物模型中显示出出色的体内抗真菌效果和良好的安全性。总体而言，这些结果表明化合物B5是开发针对Prp8 intein的抑制剂、作为新型抗真菌药物的候选物具有潜力。

引言

侵袭性真菌感染（IFIs）由于高死亡率和复发率，对全球公共卫生构成了重大威胁[1]。由于各种因素（包括免疫抑制治疗、器官移植和HIV感染），免疫功能低下的人群不断增加，导致IFIs的发病率和死亡率显著上升[2]。针对这一严峻形势，世界卫生组织（WHO）在2022年发布了《真菌优先病原体名单》，将新型隐球菌列为关键优先病原体[3,4]。这种微生物是大量感染的致病因子，每年导致超过220,000例病例和大约140,000人死亡[5,6]。

尽管现有的抗真菌药物（如多烯类、唑类和氟胞嘧啶）在临床管理隐球菌病方面至关重要，但长期使用导致了药物耐药性的日益严重问题[[6], [7], [8]]。药物靶点（如14α-去甲基化酶）的基因突变在耐药菌株的频繁出现中起着重要作用[9,10]。此外，现有治疗手段的效果常常受到治疗指数有限和药代动力学特性不佳的制约[11,12]。因此，研究具有新作用机制的先导化合物是应对这些挑战的关键策略[[13], [14], [15]]。

最近在阐明真菌特异性生物过程分子机制方面的进展为发现新的治疗靶点提供了重要见解。Prp8蛋白（前体mRNA处理蛋白8）作为剪接体的核心催化成分，在前体mRNA的成熟过程中起着关键作用[[16], [17], [18], [19]]。值得注意的是，在新型隐球菌等病原真菌中，Prp8的成熟需要一个自催化的intein剪接事件来去除intein序列[[20], [21], [22]]。哺乳动物中不存在这一过程；因此，Prp8是一个有吸引力的独特抗真菌药物靶点[23]。靶向抑制Prp8 intein已被证明可以有效地抑制蛋白质成熟，导致未剪接的前体分子异常积累，最终诱导真菌细胞死亡[24]。与传统针对细胞色素P450酶的唑类药物相比，intein靶向策略具有两个显著优势。首先，intein在真菌物种间的高度序列保守性，加上它们在哺乳动物中的缺失，提高了药物的选择性。其次，靶点突变更有可能破坏intein剪接，而不是导致药物耐药性，这有可能延缓抗真菌耐药性的发展[25]。

迄今为止，报道的Prp8 intein抑制剂包括顺铂[26]、钙霉素[27]和6G-318S[28]（图1）。在这些化合物中，6G-318S对新型隐球菌和加蒂隐球菌表现出微摩尔级的抑制活性，并且与两性霉素B联合使用时表现出显著的协同效应[28]。然而，6G-318S的临床应用受到某些限制，包括其较差的水溶性和缺乏体内药理学评估。

在这项研究中，我们以6G-318S为先导化合物，通过合理的结构优化合成了一系列1,2,3-噻二唑衍生物。其中，高活性化合物B5对新型隐球菌和加蒂隐球菌表现出显著的活性，最小抑制浓度（MIC）为0.5–1.0 μg/mL。更重要的是，B5显示出良好的药物特性，并在体内表现出显著的抗真菌效果，表明其作为治疗开发的候选物具有潜力。

部分摘要

Prp8 intein抑制剂的设计

对先导化合物6G-318S的结构分析显示，其具有一个刚性的1,2,3-噻二唑核心，两侧连接着卤素原子的苯侧链。这种构型赋予了高度的分子平面性和明显的疏水性，最终导致水溶性较差。为了提高抗真菌活性和药物特性，我们针对苯砜侧链和苯胺侧链上的氯取代基进行了结构-活性关系（SAR）研究

结论

本研究针对真菌Prp8 intein，对先导化合物6G-318S进行了结构优化，以解决其水溶性差和缺乏体内疗效数据的问题。合成了一系列1,2,3-噻二唑和噻唑衍生物，并阐明了它们的抗真菌结构-活性关系。大多数化合物对隐球菌表现出强烈的体外抗真菌活性。值得注意的是，高活性化合物B5达到了最低抑制浓度（MICs）

化学方法

实验中使用的所有化学试剂均为市售产品，无需进一步纯化。分离过程采用柱层析法（使用200–300目硅胶）。薄层层析（TLC）使用预涂硅胶板进行。高分辨率质谱（HRMS）数据由配备电喷雾离子化（ESI）的Q-Tof MS光谱仪获得。¹H和¹³C核磁共振（NMR）光谱数据

CRediT作者贡献声明

英涛：撰写——初稿，研究。林旺：撰写——初稿，研究。黄行胜：研究。方文：研究。谭晓琴：研究。朱一云：研究。孙建汉：验证，研究。万新燕：研究。田秀云：监督，资金获取。郭婷：撰写——审阅与编辑，监督。周伟：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。廖国建：撰写——审阅

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢重庆医科大学的雷云龙教授在化合物细胞毒性检测方面的帮助，以及河南农业大学的赵友宝教授在转录组数据分析方面的支持。本研究得到了CQ自然科学基金项目（CSTC2020jcyj-msxmX0439）对G. L.、国家自然科学基金（21702171）对W. Z.、国家重点研发计划（2022YFC2303100）对X. T.以及国家培训计划的资助