鉴定并过表达编码糖醇转运蛋白和代谢酶的基因，以加速酵母（Kluyveromyces marxianus）对这些物质的利用

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Identification and overexpression of genes encoding sugar alcohol transporter and metabolic enzymes for accelerated utilization in the yeast Kluyveromyces marxianus

通过CRISPR-Cas9和NHEJ方法敲除酿酒酵母Kluyveromyces marxianus的候选转运酶基因，发现KmSAT1编码山梨醇转运蛋白，KmXYL2和KmSOU2分别负责山梨醇和甘露醇的代谢。过表达这些基因显著提升对糖醇的利用效率，缩短生长滞后期，光密度高于葡萄糖培养基。

　　

江部智史（Satoshi Ebe）、中村仁美（Hitomi Nakamura）、松田光成（Mitsunari Matsuda）、寺内由纪（Yuki Terauchi）、赤田麟司（Rinji Akada）、星田久（Hisashi Hoshida）

山口大学科学技术创新研究生院应用化学系，日本宇部市常磐台2-16-1，邮编755-8611

酵母Kluyveromyces marxianus能够吸收多种糖类，包括山梨醇和甘露醇。然而，包括糖转运蛋白在内的糖类利用代谢途径仍有待阐明。为了识别这些基因，我们首先使用一种新开发的非同源末端连接（NHEJ）介导的基因破坏方法，结合CRISPR-Cas9系统进行靶向切割，共筛选出13个候选转运蛋白基因。虽然大多数突变体在各种糖培养基中表现出生长缺陷不明显，但KmMLEV2025基因（命名为KmSAT1）的突变体在山梨醇或甘露醇培养基中均无法生长，这表明该基因编码一种糖醇转运蛋白。接下来，我们研究了对糖醇代谢至关重要的脱氢酶基因，因为糖醇需要通过脱氢酶转化为果糖。已知KmXyl2p是一种木糖醇脱氢酶，因此它也是山梨醇脱氢酶的候选基因。KmXYL2的突变导致菌株在山梨醇培养基中生长受阻，而在甘露醇培养基中则无此现象。通过进一步破坏多个基因，我们发现了甘露醇脱氢酶：KmSOU2（被注释为山梨糖还原酶）的突变导致菌株在甘露醇培养基中生长受阻。这些基因的过表达有助于更有效地利用糖醇。过表达KmSAT1但不表达脱氢酶基因的菌株能够立即开始生长，而野生型菌株则需要几天时间才能生长。此外，山梨醇和甘露醇培养基中的最终细胞光密度均高于葡萄糖培养基。这些结果表明，过表达糖醇转运蛋白是生物技术应用中的有效策略。

部分内容摘要

酵母菌株与培养基

本研究中使用的K. marxianus菌株列于表S1中。酵母培养使用了YPD培养基（1%酵母提取物、2%多肽和2%葡萄糖）、YPGal培养基（YPD培养基中的葡萄糖被2%半乳糖替代）以及SD培养基（2%葡萄糖、0.17%酵母氮源（不含氨基酸和硫酸铵）、0.5%硫酸铵以及额外的营养素，包括亮氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸、色氨酸、腺嘌呤半硫酸盐和尿嘧啶）。

利用CRISPR-Cas9和NHEJ介导的标记基因插入进行基因破坏

当含有KmADE2基因的质粒pUDP082被引入K. marxianus菌株后，部分转化菌落呈现红色，表明KmADE2基因发生了突变（数据未显示）。如果切割位点发生突变，后续的CRISPR-Cas9介导的切割和DNA插入将无法进行。为避免在引入CRISPR-Cas9质粒的过程中发生突变，我们将表达Cas9的启动子进行了修改。

利用CRISPR-Cas9和NHEJ进行基因破坏

在本研究中，我们确定了K. marxianus吸收山梨醇和甘露醇所需的转运蛋白和脱氢酶。我们采用了一种新开发的基因破坏方法来识别这些基因。该方法通过CRISPR-Cas9系统进行切割，将没有同源序列的标记基因整合到目标基因中。

CRediT作者贡献声明

江部智史：撰写、审稿与编辑、数据可视化、实验验证、数据分析。中村仁美：实验研究。松田光成：实验研究。寺内由纪：撰写、审稿与编辑。赤田麟司：撰写、审稿与编辑。星田久：撰写、原始草稿撰写、项目管理、资金申请、概念构思。

致谢

我们感谢Jean-Marc Daran博士提供质粒pUDP082，帮助我们开发了本研究中的新型CRISPR-Cas9系统。本研究得到了JST SPRING（资助编号JPMJSP2111）、NAGASE科学技术基金会和大阪发酵研究所（资助编号LA-2023-018）的支持。同时，我们也感谢山口大学基因研究中心提供的分析仪器。作者声明不存在利益冲突。