《Journal of Chromatography A》：Sustainable downstream processing of
ganoderma lucidum triterpenoids: Integrated chromatographic strategies and techno-economic evaluation
编辑推荐：
灵芝三萜类化合物（GLTs）分离纯化技术挑战及优化策略，提出三种整合分离流程（路线I、II、III），分析高效液相色谱（HSCCC）和制备超临界流体色谱（Prep-SFC）对异构体分离及减少不可逆吸附的效果，结合经济环境评估（E因子）探讨不同纯度需求下的工业适用性，为标准化生产提供战略指导。
王慧|张能奇|向厚乐|寇静伟|张玉清|应汉杰|杨鹏鹏|乔浩|吴静兰
南京工业大学生物技术与制药工程学院，中国南京
摘要
灵芝三萜类化合物（GLTs）是高价值的生物活性代谢物，在制药和营养保健品领域需求日益增长。然而，由于其结构多样性（存在大量类似物和结构异构体），再加上来源的复杂性（如孢子、子实体和菌丝体），导致高分辨率分离和高纯度分离面临重大挑战。本文批判性地评估了专为GLTs设计的色谱和制备分离技术的发展。我们从色谱角度系统分析了三种集成分离流程，分别称为流程I、II和III，重点探讨了不同固定相行为和流动相配置如何应对特定样品的复杂性。评估了包括高速逆流色谱（HSCCC）和制备超临界流体色谱（Prep-SFC）在内的关键技术在分辨异构体对和减少不可逆吸附方面的有效性。此外，还提供了基于环境因素（E-factor）的技术经济和环境评估，以将分离效率与30%至90%的工业纯度要求联系起来。通过比较这些色谱模式的分辨率、通量和可持续性，本文为选择最佳纯化平台以确保灵芝产品的质量标准化提供了战略路线图。
引言
近年来，灵芝三萜类化合物（GLTs）因其显著的生物活性和不断增长的市场需求而受到广泛关注，推动了GLTs产业从传统医药应用向高价值生物活性化合物的工业生产转变[1]。虽然原材料的可用性不再是限制因素，但该行业仍面临下游加工的关键瓶颈[2]。将原始灵芝（GL）转化为药用级GLTs的过程受到低效分离技术和高运营成本的阻碍，导致市场上存在大量质量参差不齐的粗提取物，而高纯度单体则价格昂贵[3]。因此，现代GLTs产业面临的核心挑战是开发一种集成、全链的生产策略，该策略必须具有成本效益、可扩展性、操作稳定性，并符合统一的质量标准。关键的是，这一策略必须考虑原材料（子实体、孢子和菌丝体）不同的生物来源和地理分布，这些因素深刻影响着最终产品的化学特性和市场定位[4]。
灵芝（GL）原材料的生物来源包括子实体、孢子和菌丝体（图1），它们共同决定了最终产品的化学特性和市场定位。子实体主要在东亚（如中国、日本、韩国）使用原木或锯末作为培养基进行培养，其生长周期较长，有利于酸性灵芝酸的积累（通常为0.80%–2.01%）[5]。虽然它们是药用级单体的主要来源，但其加工过程因需要从共提取的色素中分离结构相似的异构体而变得复杂[6]。相比之下，来自相同栽培区域的孢子富含中性三萜类化合物（1.89%–3.15%），但被坚固的几丁质细胞壁包裹。通过脱脂策略控制脂质干扰后，孢子非常适合用于需要透皮渗透的高价值孢子油和化妆品[7]。最后，通过液体发酵生产的菌丝体具有可扩展性和批次间一致性。尽管其GLTs产量相对较低（约2.5 mg/g），但其工业可行性使其成为动物营养品和大众市场功能性食品的首选原材料，前提是能够有效分离细胞内的三萜类化合物[8]。
克服这些特定原材料带来的各种物理和化学障碍是下游加工的主要障碍。从物理角度来看，提取效率受到传质阻力的严重限制：孢子中的亲脂性GLTs被“困”在坚固的孢子壁内[9]，而子实体和菌丝体的致密纤维结构同样阻碍了溶剂的渗透[10]。传统的溶剂提取方法通常依赖过高的温度和溶剂来突破这些障碍，导致效率低下且存在环境问题。因此，行业正转向强化工艺技术，特别是超临界流体提取（SFE），该技术利用类似气体的扩散性有效穿透这些致密的细胞结构[11]。从化学角度来看，杂质成分的异质性（从子实体中的色素到孢子中的脂质）要求纯化策略也必须进行严格定制。“一刀切”的纯化方法是不够的。相反，针对不同材料的分层和特定分离策略（如对孢子的脱脂和对子实体的异构体水平分离）对于实现工业可行性和高产品纯度至关重要。纯化后，建立基于色谱指纹图谱的强大质量控制系统对于将这些提取物转化为具有验证一致性的标准化产品至关重要[12,13]。
为了全面解决这些工业瓶颈，本文根据下游加工的关键阶段组织分析，旨在弥合实验室研究与工业应用之间的差距。文章首先评估了提取技术，比较了新兴绿色方法与传统方法在传质动力学和环境足迹方面的差异。接下来，提出了定制的纯化策略，系统分析了三种集成分离流程（流程I、II和III），这些流程根据孢子、子实体和菌丝体的不同特性进行了设计。独特的是，本文结合了技术经济和环境评估（使用E-factor和成本分析），将分离效率与工业可行性联系起来。最后，文章提出了一个综合的工业路线图，并探讨了数字孪生和合成生物学等前沿领域在指导GLTs生物经济发展方面的潜力。
GLTs提取技术
GLTs的主要来源包括在原木基材上培养的子实体、通过液体发酵获得的孢子和菌丝体。
这三种来源在细胞结构和极性组成上存在显著差异，因此每种来源都需要定制的提取策略以确保提取过程的效率和选择性。这些GLTs化合物由羊毛甾烷碳骨架和五环三萜结构组成[14]。
传统提取方法
纯化策略和技术选择
本章重点分析纯化技术如何有效利用分子中极性取代基的数量和萜烯骨架的固有疏水性差异，以实现高度选择性和高效的分离。这些策略的有效性以产品纯度作为关键性能指标进行量化，纯度计算为目标化合物与总质量的比例。
基于现代分析的质量评估
建立严格的质量控制和评估系统是确保GLTs的有效性、安全性和批次间一致性的基本前提。该系统应涵盖从包括孢子、子实体和菌丝体在内的整个生产链的全面监测。目前，全球质量标准正在从基于总含量的传统粗略控制向精细化控制转变
GLTs的应用
由于其卓越的药理活性，GLTs的应用已扩展到现代社会的各个行业，包括食品、化妆品和动物营养领域，显示出巨大的商业潜力和创新价值（图4）。不同应用产品对GLTs的纯度要求各不相同。具有更强功能性的产品通常需要更高的纯度，这将在后续章节中进一步讨论。
全产业链评估
为了客观定量比较不同的GLTs制备路线，本研究构建了针对不同原材料来源的独立工业加工链。比较范围涵盖了从原材料到提取、富集、精细纯化，直至生产符合预定纯度要求的最终产品的整个价值链，包括溶剂回收和废物管理作为闭环下游操作。
下游加工瓶颈
GLTs生产的经济可行性目前受到下游加工（DSP）瓶颈的严重限制，这些瓶颈占总生产成本的60%至80%。该行业通常依赖通用的“一刀切”解决方案，通常涉及乙醇回流后进行低选择性的硅胶柱色谱。这种方法由于过度使用溶剂而导致高E-factor和低产量。此外，要达到药用级纯度（>99%）CRediT作者贡献声明
王慧：撰写 – 原始草稿、方法论、研究、数据管理、概念化。张能奇：可视化、验证、研究。向厚乐：可视化、验证。寇静伟：可视化、验证。张玉清：验证、研究。应汉杰：监督、资源管理、项目协调。杨鹏鹏：资金获取。乔浩：监督、资源管理、形式分析。吴静兰：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理。
致谢
该项目得到了中国国家重点研发计划（2022YFC2105400）的支持。
