AA10裂解性多糖单加氧酶电化学研究：揭示铜氧化还原化学及H2O2/O2还原能力的分子机制

《ACS Electrochemistry》：Electrochemical Insight into the Copper Redox Chemistry and H2O2 and O2 Reducing Capability of Two AA10 Lytic Polysaccharide Monooxygenases

本综述系统阐述了利用电化学方法探究两种AA10家族裂解性多糖单加氧酶（LPMO）的铜离子（Cu2+/1+）氧化还原特性及其对过氧化氢（H2O2）和氧气（O2）的还原催化能力。研究通过将酶固定于石墨电极表面，实现了对铜中心电子传递过程的直接监测，并首次建立了定量分析LPMO催化动力学参数（kcat/KM）的电化学新策略。这项工作为理解LPMO在生物质降解中的双底物利用机制提供了直接实验证据，显著拓展了酶电化学在碳水化合物活性酶研究中的应用边界。

　　

引言

裂解性多糖单加氧酶（LPMO）是一类含铜酶，能够催化糖苷键的氧化裂解，在微生物降解生物质过程中发挥核心作用。本研究聚焦于两种AA10家族LPMO：来源于Cellvibrio japonicus的CjAA10B和来源于Cellulomonas fimi的CfAA10。通过电化学方法，研究团队深入探索了它们的Cu^2+/1+氧化还原特性以及在无多糖条件下的H₂O₂与O₂还原催化活性。

实验方法

蛋白质生产与结构分析

研究团队制备了CjAA10BΔCBM（去除碳水化合物结合模块）和CfAA10两种酶蛋白。通过X射线晶体学解析了CjAA10BΔCBM的1.9?分辨率结构，显示其具有典型的免疫球蛋白样折叠结构，活性位点包含保守的组氨酸支架（histidine brace）铜结合 motif。AlphaFold结构预测表明CfAA10活性位点轴向位置为酪氨酸（Y177），而CjAA10BΔCBM为苯丙氨酸（F197），这种差异可能影响酶的氧化还原特性。

电化学实验流程

所有电化学实验使用定制气密三电极系统进行，以热解石墨边缘（PGE）电极为工作电极。通过蛋白质薄膜法将LPMOs固定于电极表面，采用直流伏安法（DCV）和方波伏安法（SWV）研究Cu^2+/1+氧化还原化学，通过计时安培法测定H₂O₂和O₂还原的催化活性。

pH 5电化学分析

Cu^2+/1+化学的DCV电化学分析

在pH 5.0条件下，DCV实验显示出明显的Cu^2+/1+氧化还原峰，表明LPMOs能够进行直接的电子转移。通过计算峰面积估算电极表面酶覆盖量约为8 pmol，对应较高的表面密度0.26 nmol cm^-2，表明PGE电极具有显著粗糙度。

SWV和DCV定量电子转移速率

SWV分析测得CfAA10和CjAA10BΔCBM的Cu^2+/1+电子转移速率常数（k_et）分别为0.5±0.3 s^-1和0.4±0.2 s^-1。这些相对较慢的速率表明电子转移过程伴随较高的重组能。

pH 5电催化

过氧化氢（H₂O₂）测定

计时安培实验显示，两种LPMOs均能有效催化H₂O₂还原。通过Michaelis-Menten动力学分析，CjAA10BΔCBM的k_cat为0.87±0.2 s^-1，K_M为3.8±1.1 mM；CfAA10的k_cat为1.4±0.4 s^-1，K_M为5.7±1.4 mM。

双氧（O₂）测定

对于O₂还原，CjAA10BΔCBM的k_cat为0.035±0.004 s^-1，K_M为0.14±0.02 mM；CfAA10的k_cat为0.048±0.01 s^-1，K_M为0.070±0.01 mM。值得注意的是，H₂O₂还原的k_cat值比O₂还原高一个数量级，但O₂的K_M值更低，导致特异性常数（k_cat/K_M）相当。

Cu^2+/1+信号的pH依赖性

pH从6降至4时Cu^2+/1+信号的显著增长

研究发现，降低pH值（从6.0到4.0）会导致非催化性Cu^2+/1+氧化还原峰电流显著增加。SWV分析表明，这种变化源于电活性酶分子覆盖度的增加，而非电子转移速率的变化。在pH 4.0时，电活性覆盖度最高，随pH升高而降低。

EPR探测活性位点结构随pH的变化

连续波X波段EPR光谱显示，在pH 5.0-8.0范围内，两种LPMOs仅存在一种铜物种（物种1）。然而，在pH 4.5的CfAA10样品中，检测到第二种铜物种（物种2），其占比为56%。数据分析表明，这种转变对应的pK_a值约为4.6，可能源于活性位点附近谷氨酸残基的质子化。

电催化的pH依赖性

在不同pH条件下（5.0、6.0、7.0）测定H₂O₂和O₂还原的催化活性。结果显示，虽然非催化性电子转移受pH显著影响，但催化活性在测试pH范围内保持相对稳定。这表明底物结合可能调节活性位点，抵消了质子化效应的影响。

结论

本研究建立了一种新的电化学方法，用于探究LPMOs的H₂O₂和O₂还原活性。该方法通过直接将酶"连接"到电极表面，避免中间体和报告分子的使用，提供了对LPMO活性的更直接洞察。研究发现H₂O₂是动力学上更优的底物，但考虑亲和力后，两种底物的特异性常数相当，表明LPMOs在无碳水化合物条件下能有效利用两种底物。pH对非催化性电子转移有显著影响，但催化活性在较宽pH范围内保持稳定，反映了LPMOs在不同环境条件下的功能适应性。活性位点轴向残基的差异（酪氨酸 vs 苯丙氨酸）影响酶活性，表明二级配位 sphere在调节LPMOs电活性中起关键作用。