《ACS Omega》：Decoding C-SH2 Domain/Peptide Interactions in SH2 Domain-Containing Tyrosine Phosphatase 2: A Molecular Framework for Rational Inhibitor Design
引言
SH2结构域作为药物靶点
Src同源2（SH2）结构域的发现揭示了蛋白质的模块化特性。人类基因组编码111种不同蛋白质中的121个SH2结构域，它们广泛参与信号转导、转录调控、细胞骨架调节等关键细胞过程。SH2结构域的核心功能是特异性识别并结合蛋白质中的磷酸化酪氨酸（pY）残基及其相邻氨基酸，从而介导特异的蛋白-蛋白相互作用（PPI）。由于酪氨酸磷酸化在真核细胞信号调控中扮演着至关重要的角色，尽管其仅占整个磷酸化蛋白质组的约0.5%，SH2结构域被视为极具潜力的药物靶点，尤其是在抑制PPI方面。然而，SH2结构域通常表现出较低的结合亲和力和选择性，这限制了其临床和研究应用。
含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP2）作为癌症和罕见病的治疗靶点
SHP2由PTPN11基因编码，是首个被鉴定出功能获得性突变具有致癌性的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）。与大多数PTPs负调控细胞信号不同，SHP2在信号传导中扮演正向调控角色。它广泛表达，介导多种受体酪氨酸激酶（RTKs）下游的信号转导，是RAS/MAPK通路完全激活所必需的，并调节PI3K-AKT和JAK-STAT等其他通路。因此，SHP2参与调控细胞增殖、存活、分化和迁移等多个过程。
PTPN11的体细胞突变是35%幼年型粒单核细胞白血病（JMML）病例的病因，也与其他儿童癌症相关。野生型（WT）SHP2在癌症中同样至关重要，它是RTK驱动癌细胞存活所必需的，也是靶向癌症治疗耐药性的关键节点，并介导程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）等免疫检查点通路。此外，SHP2在由幽门螺杆菌诱导的胃癌发生中也发挥作用。
SHP2不仅与癌症相关，在一组统称为RASopathies的罕见发育障碍中也扮演关键角色。特别是，PTPN11基因突变通常与努南综合征（NS，50%病例）和伴多发性雀斑样痣的努南综合征（NSML，90%病例）相关。因此，WT SHP2及其突变体是治疗癌症和发育障碍的关键治疗靶点。
SH2结构域在SHP2变构调控中的作用
SHP2的结构包括两个SH2结构域（N-SH2和C-SH2），其后是PTP催化结构域和一个非结构化的C端尾部。SH2结构域介导SHP2与RTKs、细胞因子受体、细胞粘附分子和支架适配体的结合，从而正确定位SHP2。对于SHP2而言，SH2结构域还在调节其催化活性中发挥重要作用。在无外部刺激时，SHP2处于闭合的自抑制状态，其中N-SH2结构域的DE环（“阻断环”）阻塞了PTP结构域活性位点的通道，阻止其磷酸酶活性。
SH2结构域与磷酸化序列的结合与N-SH2结构域阻断环的构象变化相关，该环失去与PTP结构域活性位点的互补性。因此，SHP2的激活与N-SH2结构域结合位点的可及性相关，该位点仅在活性状态下可用。N-SH2结构域结合位点的可及性受变构调节机制控制，该机制仍有争议，存在诱导契合和构象选择两种模型。PTPN11中的致病性突变常常破坏这一机制，导致SHP2的组成型活性形式。
与N-SH2不同，C-SH2结构域的可及性似乎不受此变构机制的影响，其结合口袋在蛋白质的失活和活性状态下始终可及。尽管C-SH2结构域可能不直接参与激活机制，但它参与招募双磷酸化的结合伴侣，增加了结合过程的亲和力和选择性。
靶向SHP2的SH2结构域的理论依据
已有多种抑制SHP2催化结构域活性位点的分子被报道，但许多存在靶标特异性差和生物利用度低的问题。即使是表现出结合选择性的分子，也被证明存在多种脱靶效应。一种替代策略是开发变构抑制剂（也称为“分子胶”），其能够稳定自抑制状态。然而，这些抑制剂对过度活跃的PTPN11突变体效果有限，因为它们的结合位点在活性构象中丢失。
多项证据表明，与结合伴侣的关联增加在SHP2病变导致RAS/MAPK通路过度激活的致病机制中起主要作用，并且适当的PPIs对于磷酸酶的正确功能是必需的。基于这些考虑，研究者提出了一种替代策略，专注于靶向由SH2结构域介导的SHP2 PPIs，而非其催化活性。研究者开发了一类新型的基于肽的抑制剂，可破坏SHP2 PPIs，对N-SH2结构域具有纳摩尔级亲和力、高选择性、抗降解性以及对SHP2致病性变体的强亲和力。由于SHP2的变构行为，这些抑制剂特别适用于高度激活的致病性变体，其中N-SH2结合位点始终可及，但对WT蛋白和具有最小激活的变体效果较差。相比之下，由于C-SH2结构域的结合位点在磷酸酶的两种激活状态下都可及，针对该结构域的PPI抑制剂预计对WT蛋白和自抑制状态为主的变体也有效。靶向WT SHP2是治疗多种癌症和发育综合征的有前景的策略。此外，如果能够获得分别特异性靶向SHP2的N-SH2和C-SH2结构域的两种PPI抑制剂，则将可能设计能够同时与磷酸酶的两个SH2结构域相互作用的双磷酸化分子。这种方法将显著提高PPI抑制剂的结合亲和力和选择性。最后，选择性靶向N-SH2和C-SH2结构域的能力将成为研究SHP2作用、其PPIs及其变构机制在不同通路激活和各种病理中作用的宝贵生化工具。
SH2结构域的结构与结合特性
SH2域的结构为了解其结合特性提供了关键信息。SH2域显示出高度保守的拓扑结构，由α螺旋和β链按βαβββββαβ的顺序排列。SH2域有两个主要区域：负责结合磷酸化蛋白的“pY结合腔”和决定序列特异性的“特异性决定区”。在大多数SH2-配体结构中，磷酸肽序列以伸展的构象结合，横跨结构域表面，与中心β片层垂直。结构域的一侧（N端区域）包含αA螺旋和BC环，pY结合位点位于此处。另一侧（C端区域）包含αB螺旋、EF和BG环，它们控制着磷酸肽结合区的可及性并影响结合特异性。
pY结合口袋在SH2结构域中通常是保守的。最保守的残基是R(βB5)（存在于98%的人类SH2结构域中），属于“FLVRES”基序，它与磷酸基团形成盐桥，这是最主要的pY稳定相互作用，并负责pY结合的特异性。另一个通常保守的R残基是R(αA2)（存在于82%的人类SH2结构域中），它与磷酸基团相互作用，并与pY酚环形成氨基-芳香相互作用。该残基与K(βD6)一起，通常形成围绕pY的钳形结构。此外，BC环也通过形成氢键（H-bonds）有助于稳定肽/结构域复合物。
结果与讨论
C-SH2结构域结合磷酸肽的结构决定因素
N-SH2和C-SH2结构域的结构比较
开发对C-SH2相互作用具有选择性的结合剂，将提供具有潜在制药应用价值的分子，以及用于阐明SHP2调控和功能中几个有争议方面的宝贵生化工具。从这两个角度来看，理解稳定与C-SH2特异性结合的相互作用尤为重要。
两个结构域不同的变构行为可能主要与EF环中的单个残基替换有关。在N-SH2结构域中，该环的打开和关闭受Y66(EF1)侧链构象的控制。在C-SH2结构域中，该残基被G182(EF1)取代，且EF环包含三个连续的G残基，因此可能由于缺乏侧链的空间位阻，EF1残基无法调节EF环的构象。
关于特异性决定区，在N-SH2结构域的BG环中，K89(BG5)和K91(BG7)与结合肽中+4和+2位点的带电侧链形成盐桥，有助于肽结合和选择性。在C-SH2结构域中，这两个K残基分别被V203(BG4)和T205(BG6)取代，因此失去了形成涉及这些残基的盐桥的可能性。在结合口袋的C端部分，两个SH2结构域呈现出的疏水区域范围略有不同。
在与磷酸肽pY残基N端片段相互作用的结构域区域，C-SH2结构域包含两个K残基（K120(αA3)和K166(βB2)），而N-SH2结构域只有K35(BC1)，它间歇性地与肽的-1位残基形成盐桥。
大多数SH2结构域在pY结合口袋中形成多个盐桥。SHP2的N-SH2结构域也是如此，而C-SH2结构域在这方面很特殊，因为它仅依赖关键的R138(βB5)与pY形成稳定的离子对。C-SH2结构域缺少3个参与与pY形成盐桥的保守残基中的2个，即R(αA2)和K(βD6)（在这些位置分别是G和M）。N-SH2结构域缺少R(αA2)，但保留了K55(βD6)，并且在BC环中有一个阳离子残基（K35(BC1)），可以与pY形成额外的盐桥。这种补偿性相互作用在C-SH2结构域中也缺失了，因为相应的位置被无法形成离子相互作用的Q141(BC1)占据。
两个结构域之间的另一个结构差异是CD环的长度不同（C-SH2和N-SH2结构域中分别为12和3个残基）。上述讨论的差异可以为两个结构域不同的变构行为和结合特性提供线索。
C-SH2结构域的序列选择性
关于C-SH2结构域的结合选择性，有多种可用数据，包括天然结合剂的序列、定量肽结合研究以及高通量定性肽库实验。
早期研究已经鉴定出几种通过其SH2结构域与SHP2相互作用的蛋白质。此外，文献中报道了几种C-SH2结构域的肽配体。对一些序列和人工肽进行了定量结合研究。总结显示，对SHP2的C-SH2结构域具有高结合亲和力（亚微摩尔解离常数）的磷酸化序列，除少数例外，可以定义一个共有模式，其优选残基类型为：+1和+3位点为疏水残基，+5位点为芳香族残基，-1位点为阴离子残基。
同时，通过磷酸肽文库的高通量研究也分析了SHP2的C-SH2结构域的序列选择性。基于这些研究的结果，在-3到+6位点识别出了结合偏好。在+1和+3位点明显偏好疏水残基，这与天然结合剂序列一致；在+2位点偏好极性残基；在-3位点偏好阴离子和疏水残基。其他位点，如+4、+5和+6，似乎不太明确，研究表明存在阳离子或芳香族残基。
C-SH2结构域的结构和动力学分析
C-SH2/磷酸肽复合物的结构与MD模拟
C-SH2结构域与磷酸肽复合物的可用实验结构包括来自PD-1 ITSM基序、PDGFR、CagA EPIYA-D、CagA EPIYA-C和TXNIP的天然序列。在以下部分中，将分析这些结构中决定结合亲和力和选择性的相互作用。然而，X射线结构提供的是静态图像，无法指示可能的构象转变或相互作用的稳定性。为了获得更深入的理解，研究者对七种不同的C-SH2结构域复合物进行了分子动力学模拟。大多数模拟侧重于-3到+5位残基。最小化肽序列对于肽可能的治疗应用是可取的，这一选择也得到了两项先前研究的支持：对gp130肽的研究表明，-2到+5的最小序列足以保留全部结合亲和力；研究者之前的文库研究表明-3位残基也有特异性偏好。在一个案例中，还测试了-4到+6的序列，以便与使用相同肽获得的NMR数据进行比较。此外，研究者分析了来自天然配体的序列，并测试了基于肽库筛选研究结果选择的各种氨基酸取代的效果。
C-SH2/PD-1 ITSM复合物的NMR结构具有最高的实验测定结合亲和力，作为研究者模拟的起点。由于没有Gab1、IRS-1或人工序列复合物的结构数据，研究者通过肽配体中进行必要的替换，来适应这些模拟。
-1至+5磷酸肽区域与结构域稳定相互作用
在所有模拟中，肽在整个轨迹中都牢固地结合在结构域上，但其N端部分显示出显著的流动性。每个残基的平均均方根波动有效地说明了这种行为。在所有情况下，0到+4位残基的RMSF值低于2 ?，并且在大多数轨迹中，稳定的伸展区域从-1延伸到+5。相比之下，-1之前的残基在所有模拟中的RMSF值都大于2 ?。晶体结构中观察到的德拜-瓦勒因子得到的RMSF值以及NMR溶液结构中看到的变异性，通常与-1到+4区域的低流动性一致。更重要的是，实验结构的重叠表明，肽的N端序列在不同结构间存在显著的构象异质性。这些发现与肽库研究的结果形成对比，后者表明N端残基可以显著影响结合亲和力，并且N端肽残基在大多数X射线结构中得到解析。后一发现可能是由晶体场效应引起的。MD模拟中观察到的N端区域的灵活性以及肽库研究的结果，如果考虑到结合肽与C-SH2结构域之间瞬时的离子对相互作用，就可以变得一致。这种相互作用可以通过MD模拟变得明显，MD模拟有效地捕捉了这些区域的构象灵活性和瞬时相互作用的倾向。
肽的C端区域主要呈伸展构象
肽骨架的拉马钱德兰图显示，在晶体结构中，所有残基的肽始终采用伸长构象。在不同的NMR构象中发现了更高的变异性，但中心区域（-2到+3残基）也大多呈伸展结构。在模拟研究中，肽的中心片段（包括0到+3位残基）保持伸展构象，+4和+5位残基也经常被发现呈伸展结构。相比之下，N端片段（-4到-1位残基）表现出更大的灵活性，探索了拉马钱德兰图的不同区域。
配体C端区域的伸展构象由肽骨架和C-SH2结构域之间的氢键网络稳定。这些键主要涉及肽残基+1、+2和+4，以及蛋白质残基H169(βD5)、T205(BG6)和V203(BG4)。这些相互作用在所有晶体结构中都被观察到，并在模拟过程中持续存在。相应的氢键之前在N-SH2结构域肽复合物的模拟中也观察到。此外，在NMR数据中，以及在不同稳定性的几次模拟中，+1位残基与M171(βD7)形成氢键。无论在结构中还是模拟中，均未观察到涉及肽N端区域的稳定氢键，这与相对较高的灵活性相一致。
磷酸酪氨酸相互作用
如前所述，磷酸肽/SH2结构域复合物也通过pY残基与其结合位点的相互作用而强烈稳定。
C-SH2结构域的特点是pY口袋中只有一个阳离子残基，即高度保守且至关重要的R138(βB5)。R138-pY盐桥在所有实验结构和所有模拟中持续观察到。pY残基还通过氢键网络进一步稳定，这通常涉及S(βB7)和BC环的残基。研究者的数据证实了这些相互作用：pY的磷酸基团在NMR结构和模拟中与S140(βB7)的侧链和S142(BC2)结合，但在晶体结构中则没有。BC环的主链也参与了与pY形成氢键。这些相互作用与N-SH2结构域形成的相互作用相似，但N-SH2结构域有一个由T42(βC3)残基形成的额外非常稳定的侧链氢键。C-SH2结构域中相应的氨基酸是V148(βC3)，因此不可能形成这种相互作用。尽管H143(BC3)和H169(βD5)在空间上靠近pY磷酸基团，但没有观察到氢键。然而，这一发现并不排除其在磷酸盐识别中的功能或结构作用。
总体而言，数据表明pY残基在C-SH2结合口袋中由比N-SH2结构域中观察到的更少的相互作用稳定。这些差异可能有助于解释最近观察到的两个结构域对不同pY模拟物的不同偏好。对于旨在设计针对C-SH2而非其他SH2结构域的选择性肽的研究，可以利用这一特性，通过掺入合适的不可磷酸化的pY类似物。
“特异性决定区”：+1和+3位残基插入疏水口袋
基于C端pY残基结合区域（即特异性决定区）的相互作用，SH2结构域被分为三类。SHP2的C-SH2结构域属于II型，称为“开放凹槽”或“PLC-γ1样”。通常，在这类结构域中，肽垂直于中心β片层结合，其中C端pY残基具有pY-疏水-X-疏水的模式，嵌入一个延伸至+5位的长疏水凹槽中，该凹槽由EF和BG环界定。
肽侧链的溶剂可及表面积能够定量分析模拟和实验结构中的非极性相互作用。+1和+3位残基始终嵌入疏水凹槽内，而+2和+4位残基则面向溶剂。这种模式在+5位残基处被打断，该残基暴露于溶剂。+1和+3位残基与排列在凹槽中的疏水氨基酸相互作用。特别是，+1位残基与V170(βD6)、L210(βG3)、T168(βD4)侧链中的甲基以及E204(BG5)侧链中的脂肪族基团相互作用。+3位残基总是与V170(βD6)、V181(βE4)、G182(EF1)、G183(EF2)、M202(BG3)和L210(βG3)以及E204(BG5)侧链中的亚甲基基团相互作用。
这些发现与肽库研究中在+1和+3位点普遍存在非极性氨基酸的现象一致。+5位残基的溶剂暴露性与II型家族中C-SH2结构域在+5位点缺乏对疏水侧链的特定偏好性一致。
在模拟中，肽的N端残基都暴露于溶剂，这与该区域的显著流动性相平行。即使在GAB1模拟中-2位存在V，其侧链仍然暴露于溶剂。实验结构的分析大多与模拟结果一致，除了-2位残基，它在X射线结构中并未暴露于溶剂，这可能是由于该区域的晶体场效应。事实上，在NMR结构中，-2位存在的极性T残基比晶体结构中相应位置的疏水侧链更暴露于溶剂。另一方面，肽库研究表明-2位存在疏水残基，这可能有助于pY结合口袋的正确形成，因为C-SH2结构域缺少通常形成pY结合腔壁的保守RαA2残基。
在此背景下，模拟数据清楚地表明，-2和-3位残基在调节pY侧链溶剂暴露中起关键作用。计算出的pY侧链溶剂暴露值具有显著性。包含-2位残基的N端延伸导致序列依赖性的溶剂暴露减少。有趣的是，进一步延伸至-3位残基放大了这种“笼蔽”效应。这些结果表明，修饰N端序列可能是进一步减少pY溶剂暴露和稳定结合环境的有效策略。
溶剂暴露残基的相互作用
+2、+4和+5位残基是溶剂暴露的，但可能与界定C端肽部分结合凹槽的EF和BG环发生相互作用。确实观察到PD-1肽的T+2与T205(BG6)之间在NMR结构和PD-1_W+5模拟中形成稳定的氢键，PD-1_R+4模拟中R+4与T205(BG6)之间，以及PD-1_W+5模拟中W+5与G182(EF1)之间。
基于肽库研究，SHP2的SH2结构域是为数不多的例外，其中pY N端的残基对结合很重要。与这一发现一致，并且尽管N端片段相对于C端具有相对较高的流动性，在NMR结构以及IRS-1和PD-1_R+4模拟中观察到结构域与-2位极性侧链之间的氢键。此外，还观察到了几个离子对相互作用。PD-1及其类似物的MD模拟显示，-1位的E残基可以与结构域的两个不同K残基形成盐桥：K120(αA3)和K166(βD2)。这些相互作用的寿命比在肽C端区域观察到的残基短，使得该区域更灵活。然而，它们的存在，在结构和模拟中都能清晰检测到，可能有助于稳定整体的肽/结构域相互作用。
与PD-1衍生
