《Reproductive and Developmental Medicine》：Corrigendum: Association between luteinizing hormone level decrease on the triggering day and pregnancy outcome for in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection patients following gonadotropin-releasing hormone antagonist protocol: a retrospective cohort study
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本综述系统探讨了人未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）技术的临床进展。文章指出IVM的成功关键取决于未成熟卵母细胞的来源，并详细评述了不同IVM方案、培养条件（如培养基成分、共培养系统）以及新兴的CAPA-IVM和OSC-IVM技术。作者强调，结合温和刺激周期、同时获取成熟与未成熟卵母细胞并进行IVM，可能为不孕症治疗和生育力保存提供一种更安全、有效的替代方案。随着技术进步，IVM有望成为辅助生殖领域的重要选择。
引言
20世纪初，研究发现哺乳动物未成熟卵母细胞从卵泡中释放后可在体外完成成熟过程。最初在啮齿类和兔子中观察到这一现象，随后从手术切除的卵巢组织中获取了人未成熟卵母细胞。有趣的是，人类体外受精（IVF）技术的发展最初也涉及使用体外成熟的卵母细胞。然而，1978年世界上首例试管婴儿的诞生源于体内成熟的卵母细胞，而非未成熟卵母细胞的IVM。临床上的体外成熟（IVM）是指将处于不同发育阶段（包括生发泡GV期和减数分裂I中期M-I期）的人未成熟卵母细胞在培养液中成熟的过程。人GV期卵母细胞的IVM过程通常至少需要36小时，尽管早期报告称仅需12小时，因为部分获取的未成熟卵母细胞已处于M-I阶段。随着IVF技术的进步和伦理道德的批准，首例源自IVM卵母细胞的婴儿于1983年诞生。此后，已有报告显示数千名健康婴儿通过IVM技术出生。2021年，美国生殖医学学会（ASRM）实践委员会指出，IVM不应再被视为实验性程序，并认可其广泛的临床应用潜力，但同时强调IVM并非适用于所有患者，主要推荐用于高窦卵泡计数（AFC）的个体。近年来，关于IVM技术用于不孕症治疗和生育力保存的报告提供了更新信息。因此，本文旨在评述IVM技术的临床进展。
未成熟卵母细胞的来源
未成熟卵母细胞的来源是IVM技术成功临床应用的关键点。过去几十年，针对IVM的临床应用开发了许多方案。这些方案可根据未成熟卵母细胞是否来自经过促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）或两者联合进行预处理的女性进行分类。目前，IVM治疗的整体成功率仍被认为低于常规体内成熟卵母细胞。然而，直接比较IVM与常规IVF的成功率可能并不恰当，因为IVM技术根据未成熟卵母细胞的来源和质量也能实现较高的活产率。IVM对于不孕症治疗和生育力保存仍是一项有价值的技术，其结局与未成熟卵母细胞的质量密切相关。与常规IVF治疗类似，IVM的成功率似乎与获得的未成熟卵母细胞数量相关。
近年来，获能（CAPA）-IVM技术已被应用于人类不孕症治疗的IVM中，报告显示已有超过1000名健康婴儿通过此程序出生。CAPA-IVM的概念最初在牛IVM实践中提出，随后在家畜中进行了广泛测试。小鼠和牛模型的研究表明，应用CAPA-IVM可随时间依赖性改善卵母细胞的发育能力。这通常通过添加环磷酸腺苷（cAMP）或C型钠尿肽（CNP）来抑制卵母细胞减数分裂成熟来实现。开发CAPA-IVM的基本原理是基于这样的认识：虽然从小窦卵泡获取的卵母细胞几乎已完全长大，但它们仍然具有转录活性，并继续进行细胞质成熟和识别过程，这些过程对于支持受精后胚胎发育的初始阶段至关重要。这些细胞质过程在体内通常发生在自然排卵前卵泡期的数天内。因此，CAPA-IVM旨在通过允许细胞质成熟在诱导核成熟之前发生来模拟这一体外过程。CAPA-IVM的目标是创造一个有意将卵母细胞维持在减数分裂停滞状态的环境，同时保持不间断的卵母细胞-卵丘细胞通讯，从而促进体外细胞质的持续发育。
卵泡的大小和阶段是决定未成熟卵母细胞IVM潜力的重要因素，因为成熟率与卵泡的大小和阶段直接相关。在家畜（特别是牛）的IVM应用中，可以收集大量卵巢样本并转移到实验室，穿刺所有可见卵泡，并选择形态最佳的卵丘卵母细胞复合体（COCs）进行培养。普遍认为，大多数直径大于6毫米的卵泡中的COCs已开始闭锁过程。因此，选择健康的COCs是牛IVM技术的一个重要方面。事实上，使用从屠宰场获得的牛卵巢材料的研究表明，当仅选择高质量的COCs（约占所有穿刺卵泡的10%–20%）时，通过IVM技术可获得相对较高的卵母细胞成熟率。这一观察结果与以下假设一致：即超过70%直径大于6毫米的闭锁卵泡在穿刺时已经发生闭锁。
CAPA-IVM方案最初是为家畜开发的，后来被用于人类临床应用，特别是在患有多囊卵巢综合征（PCOS）的不孕女性中，这些女性的COCs来源于直径小于6毫米的卵泡。然而，用于人类的改良版CAPA-IVM方案与用于动物的方案不同。改良版CAPA-IVM方案包括在获取未成熟卵母细胞前使用FSH刺激卵巢数天，其假设是FSH刺激可以减少卵泡闭锁。这引发了一个关键问题：如果此处应用了卵巢刺激，为什么不继续刺激那些卵泡以获得体内成熟的卵母细胞用于临床应用？此外，如果CAPA-IVM需要额外一天的培养来完成未成熟卵母细胞的成熟，为什么不将取卵推迟一天？那样的话，未成熟的COCs就不需要在体外进行抑制，并且支持这些未成熟COCs的体内卵泡微环境可能比体外CAPA-IVM条件（依赖CNP抑制减数分裂恢复24小时）更为有利。
尽管如此，临床研究报告称，使用CAPA-IVM方案代表了该领域的重大进展，为传统IVF体验提供了一种更安全、成本更低、情感负担更轻的替代方案。CAPA-IVM方案已在正常排卵和PCOS患者中得到验证，表明未成熟卵母细胞应来源于小卵泡（直径<6毫米）且必须处于GV期。然而，必须认识到IVM技术是更广泛的IVF治疗过程的一个组成部分，其特点是临床应用方案不同，其成功完全取决于未成熟卵母细胞的来源。因此，尽管CAPA-IVM在人未成熟卵母细胞中报告了有希望的结果，但其从动物模型到人类的适应不应被视为IVM技术临床应用的突破，因为IVM仅是整个IVF程序中的一个步骤，而非完整的治疗本身。
培养介质和系统
人卵母细胞在卵泡发育（卵母细胞生长和成熟）过程中获得了一系列在受精和随后的早期胚胎发育中起关键作用的能力。通过IVM获得的卵母细胞质量深受培养条件的影响；因此，培养介质在未成熟卵母细胞IVM程序的成功中起着至关重要的作用。早期的IVM培养基由近50%的卵泡液（FF）或血浆（血清）组成。虽然已经积累了大量数据，但为人类未成熟卵母细胞IVM选择特定培养基的基本原理似乎主要源于对培养其他细胞类型方法的借鉴。组织培养液-199（TCM-199）已广泛用于动物未成熟卵母细胞的成熟，随后应用于人IVM。然而，研究表明TCM-199的成分，特别是某些组分，对于人未成熟卵母细胞的体外成熟并非最优。
几十年来，IVM培养基的组成经历了修改，但目前现有的人未成熟卵母细胞IVM培养基是基于添加了不同物质的复杂培养基。有许多优秀的综述文章描述了IVM培养基的基本成分以及个别添加剂的功能作用。复杂的培养基通常包含能量和氮源、维生素、抗氧化剂、用碳酸氢盐缓冲，并补充各种血清（蛋白质）、促性腺激素（FSH和LH）、胰岛素、生长因子（双调蛋白、cumulin、溶血磷脂酸等）、多胺（腐胺）和类固醇。内源性和外源性信号，如促性腺激素、生长因子、胰岛素和皮质醇，作为上游调节因子调节卵泡脂质代谢稳态，从而维持卵母细胞减数分裂和细胞质成熟。
制作最佳IVM培养基的理念是模拟含有健康成熟卵母细胞的FF成分。FF减数分裂激活甾醇（FF-MAS）在哺乳动物FF中被发现浓度很高，表明其参与卵母细胞成熟的调控。动物研究表明，在IVM培养基中补充FF-MAS以剂量依赖性方式诱导减数分裂恢复，并增强卵母细胞核质成熟的同步性。然而，有趣的是，向IVM培养基中添加FF-MAS并未显示能改善人未成熟卵母细胞在IVM或早期胚胎发育方面的结果。这表明在体外条件下模拟FF成分对于未成熟卵母细胞的IVM并不奏效。
内源性抗氧化剂如褪黑素已被提议作为动物和人类IVM培养基的有益补充剂。然而，最近一份报告指出，在猪的卵母细胞成熟和胚胎培养期间补充褪黑素并未显著改善IVM率或胚胎发育结局。尽管各种研究报告称IVM期间的卵母细胞质量受不同培养基和添加剂的影响，但特定因子在体外增强卵母细胞成熟和质量的确切机制仍不清楚。大量研究表明，每种成分都能促进体外卵母细胞成熟、受精和胚胎发育，但培养基中每种因子的功能必须协同作用才能达到最佳效果。
最近的研究报告称，人卵母细胞成熟的调节是一个多因子过程，涉及几种不同信号转导通路的激活。作者证明了在卵母细胞成熟期间某些物质（包括双调蛋白、抑制素-A和抑制素-B、中期因子以及潜在的FF-MAS）的强烈上调。此外，CNP的作用可能发生在受体水平，这表明在IVM程序期间，在小的培养滴中模拟体内卵母细胞成熟时的卵泡内条件可能会增强卵母细胞核和细胞质的成熟。此外，对刺激周期中不同成熟阶段（GV、M-I和M-II）卵母细胞和卵丘细胞（CCs）之间发生的分子相互作用的研究揭示，卵母细胞成熟是一个复杂且动态的过程。M-I期卵母细胞可进一步分为两种亚型：GV样M-I期卵母细胞和M-II样M-I期卵母细胞。作者还发现，在卵母细胞成熟的后期阶段，CCs中的脂质和胆固醇代谢很活跃，表明脂质可能作为卵母细胞和胚胎发生的有效能量来源。
未成熟卵母细胞及其周围的CCs在卵泡中形成一个不可分割的整体（）。卵母细胞的成熟依赖于卵母细胞与周围CCs在直径小于6毫米的卵泡中的通讯，因为这些卵泡具有转录活性，并且卵母细胞继续获取/重排其细胞器（细胞质成熟），这对于支持受精后的早期胚胎发育至关重要。在未成熟卵母细胞IVM程序开始时，为卵母细胞-卵丘细胞对话（缝隙连接）提供适当的培养条件非常重要。卵母细胞和CCs通过透明带内的缝隙连接和旁分泌信号进行双向通讯，共同进展。一些代谢底物和小分子通过缝隙连接和旁分泌途径在卵母细胞和CCs之间交换。总体而言，卵母细胞分泌各种因子调节CCs的增殖、分化和凋亡。反过来，CCs为卵母细胞提供其生长和发育所需的能量来源。众所周知，将CCs与胚胎或剥除卵丘的未成熟卵母细胞共培养可以改善胚胎发育或IVM后的卵母细胞质量。
最近一项研究调查了人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的卵巢支持细胞（OSCs）和去除卵丘的人未成熟卵母细胞的基因表达谱在IVM程序共培养期间是否受到双向影响。作者报告称，OSC-IVM平台是一种用于挽救人未成熟卵母细胞成熟的新方法，产生的卵母细胞具有改善的核成熟度，并且转录组与体内成熟卵母细胞更相似，表明卵母细胞质成熟可能得到增强。基于这些结果，作者推测OSC-IVM程序后卵母细胞质量的改善可能是通过去除卵丘的卵母细胞和OSCs之间的双向对话发生的。最近，有研究报道使用人干细胞来源的OSC进行小鼠未成熟卵母细胞的IVM，显著提高了囊胚形成率，并实现了健康的活产，且无生殖毒性迹象。这些结果表明，人干细胞来源的OSC的安全性和有效性可以应用于IVM程序，作为生殖医学中的潜在替代方案。尽管OSC-IVM有前景，但目前尚无比较证据表明使用患者自身CCs共培养与使用异源OSCs共培养对于未成熟卵母细胞IVM的效果孰优孰劣。从实践、安全和伦理角度考虑，对于临床应用，使用患者自身的CCs与未成熟卵母细胞进行IVM共培养可能比使用异源OSCs更可取，特别是如果两种方法产生相同或相似结果时。
尽管已探索了多种培养方法用于未成熟卵母细胞的IVM，但通常有两种培养系统可用于未成熟卵母细胞的IVM。第一种是微滴培养系统，使用20–50 μL的培养液滴在石蜡油覆盖的培养皿上。第二种是双孔培养皿系统，由一个内含1.0 mL培养液的内孔和一个内含2.0 mL培养液的外孔组成，覆盖或不覆盖石蜡油。虽然有关于卵泡生长的2D或3D培养系统的报告，但关于使用这些培养系统进行未成熟卵母细胞IVM的信息有限。无论使用哪种培养系统，最好在使用前向IVM培养基中补充促性腺激素、生长因子、类固醇以及胰岛素，因为这些激素和生长因子在IVM培养基中的活性半衰期较短。
IVM技术的发展
随着IVM技术的不断发展，一个提高结局的诱人可能性是结合自然周期获取成熟和未成熟卵母细胞，然后对未成熟卵母细胞进行IVM。如果从优势卵泡获取成熟卵母细胞的同时，也能从小卵泡收集未成熟卵母细胞，那么当设法使这些未成熟卵母细胞成熟并产生几个 viable 胚胎时，怀孕的机会将大大增加。有趣的是，在主导卵泡直径达到12–14毫米时注射hCG后36小时，可以从主导卵泡获取成熟卵母细胞，同时也可以从小卵泡收集未成熟卵母细胞，这表明一些小卵泡可以对LH峰做出反应以触发卵母细胞成熟，这些卵母细胞可能在体内完全成熟。自然周期IVF/M联合IVM单独治疗可以为超过一半寻求不孕治疗的不孕女性提供可接受的妊娠率和着床率，表明自然周期IVF/M可能是月经周期规律的年轻女性最合适的治疗方法。
有趣的是，国际温和辅助生殖方法学会（ISMAAR）委员会进行了一项最新的文献检索，证据根据牛津大学循证医学中心的标准进行分级。ISMAAR建议在所有临床环境中采用温和的卵巢刺激方法，因为越来越多的证据表明温和刺激与常规刺激同样有效，同时更安全、成本更低。温和的卵巢刺激可以取代常规刺激，从而使IVF在全球范围内更安全、更易获得。
随着IVM技术的进一步发展，结合温和刺激周期、获取成熟和未成熟卵母细胞并进行IVM技术，可能为常规刺激治疗提供一种可行的替代方案。现在是时候重新考虑IVM技术及其发展了。结合获取成熟和未成熟卵母细胞并进行IVM，最终可能成为辅助生殖技术中最优的一线治疗方法。
结论
根据人未成熟卵母细胞的来源，已经开发了各种IVM方案。然而，没有确凿证据表明任何一种IVM方案更优。未成熟卵母细胞的IVM深受培养条件的影响，在IVM培养基中添加各种添加剂推动了IVM技术的改进。虽然用于未成熟卵母细胞IVM的与CCs的共培养系统已很成熟，但与人干细胞来源的卵巢支持OSCs共培养对于提高未成熟卵母细胞质量和改善IVM技术临床应用性的有益效果仍是一个活跃的研究领域。随着IVM技术的发展，结合温和刺激周期、获取成熟和未成熟卵母细胞并进行IVM，可能为不孕症治疗和生育力保存提供一种可行的替代方案。
