《Biochimie》：Relationship between structure and function of the NADH oxidase from
Lactobacillus brevis
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本研究解析了乳杆菌LbNOX的酶学特性，发现其活性依赖于二聚体结构和FAD辅因子，pH变化显著影响酶构象及活性，为工业氧化还原反应开发提供理论支持。
马蒂厄·唐德林格（Mathieu Dondelinger）|玛丽琳·S·范德文（Marylène S. Vandevenne）|弗雷德里克·克尔夫（Frédéric Kerff）|莫雷诺·加莱尼（Moreno Galleni）
列日大学（University of Liege）InBios蛋白质工程中心，地址：13 Allée du 6 Ao?t，B-4000 列日，比利时
摘要
产水的NADH氧化酶通过分子氧氧化NADH来生成NAD+和水。这些酶需要FAD作为辅因子来执行其酶促活性，并有助于细菌抵抗氧化应激。由于NAD+的回收活性，这些酶受到了广泛关注，因此可能成为各种工业氧化还原过程的首选候选者。然而，大多数这类酶是以脱辅基酶的形式在重组宿主（例如大肠杆菌）中产生的，因此需要通过与FAD共孵育来激活。
在这项研究中，我们描述了来自短乳杆菌（Lactobacillus brevis）的NADH氧化酶（LbNOX）的特性。LbNOX是一种同源二聚体黄素酶，每个单体包含一个非共价结合的FAD分子。研究表明，LbNOX的生产、纯化和配方过程会产生一种非均一的酶溶液。活性二聚体形式依赖于pH值，并且与FAD的存在相关。我们还对LbNOX的结构进行了全面的生物信息学分析，确定了影响pH依赖性二聚化的关键残基，并发现FAD紧密地结合在二聚化界面。
这种结构和功能上的表征对于完全理解该酶的激活机制至关重要，并将有助于开发一种稳定且可重复的方案，用于生产、纯化和配制完全活性且均匀的酶溶液。更广泛地说，这项工作将有助于推动基于NADH氧化酶的工业应用及其FAD依赖性激活机制的发展。
部分内容摘录
引言
依赖烟酰胺辅因子（NADH或NADP）回收系统的工业过程和生物转化数量正在迅速增加。与氧化还原回收系统耦合的酶促反应的一个最相关的例子是酒精氧化（图1），该过程涉及一类称为脱氢酶的酶。这些酶被广泛用于催化精细化学中的各种氧化还原反应，例如外消旋底物的动态动力学拆分等。
LbNOX的生产与纯化
编码LbNOX的基因（Uniprot ID Q8KRG4）由GeneCust（法国）合成，其密码子使用已针对大肠杆菌的表达进行了优化。该基因被克隆到pET28a质粒中，位于NdeI和XhoI限制性酶切位点之间，并通过以下连接序列在N端连接到His6标签：MGSSHHHHHHSSGLVPRGS。通过DNA测序验证了所得质粒的完整性。
将所得质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中以表达LbNOX。
LbNOX的生产与纯化
编码带有N端His6标签的LbNOX蛋白的合成基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。通过IMAC纯化后，SDS-PAGE分析确认了蛋白质的高纯度，显示出一个与预期分子量相符的单一条带（理论分子量为51.1 kDa，见补充图1）。蛋白质储存在pH 6.0的醋酸钠缓冲液中，置于-20°C条件下，以备后续的酶学实验使用。根据280 nm处的紫外吸收和BCA测定，估计产率为
LbNOX的活性与二聚体形式相关
我们的动力学实验发现FAD对底物亲和力有显著影响：当反应缓冲液中存在FAD时，LbNOX对NADH的表观亲和力降低（KM值升高）。这一观察结果表明LbNOX可能通过多种机制发挥作用，这与Argyrou和Blanchard提出的催化模型一致。
更广泛地说，我们的结果表明LbNOX的活性与其二聚体形式以及FAD的存在有关。
结论与见解
本研究强调了LbNOX活性对其二聚体形式和FAD辅因子存在的严格依赖性。这种寡聚状态受pH值强烈影响，但并不一定与活性直接相关，因为也可以观察到无活性的二聚体脱辅基酶。这些发现强调了配方参数必须严格控制，因为它们对蛋白质的结构构象、辅因子的保留和稳定性有重要影响。由于LbNOX的重组生产存在
CRediT作者贡献声明
马蒂厄·唐德林格（Mathieu Dondelinger）：撰写初稿、方法学设计、数据分析、概念构建。玛丽琳·S·范德文（Marylène S. Vandevenne）：撰写、审稿与编辑、数据分析。弗雷德里克·克尔夫（Frédéric Kerff）：撰写、审稿与编辑、数据分析。莫雷诺·加莱尼（Moreno Galleni）：撰写、审稿与编辑、监督、概念构建
资金来源
本研究得到了欧洲区域发展基金（ERDF）和瓦隆大区在“Wallonia-2020.EU”运营计划框架内的财政支持。
弗雷德里克·克尔夫（Frederic Kerff）是F.R.S.-FNRS的研究员。
致谢
作者感谢Fabrice Bouillenne在SEC-MALS实验中的协助，以及Georges Feller在DSC实验中的工作。同时，作者感谢BE Instruct-ERIC中心的Robotein?平台提供了用于进行DSF实验的Microlab STAR液体处理工作站。
