《Experimental Eye Research》：Duplex droplet digital PCR (ddPCR) improves the diagnosis of
Aspergillus and
Fusarium keratitis
编辑推荐：
真菌角膜炎诊断中双联数字PCR（ddPCR）与qPCR的敏感性和特异性比较，结果显示ddPCR在曲霉属（84.21%敏感度，94.64%特异性）和毛霉属（75%敏感度，96.3%特异性）检测中均优于qPCR，为快速诊断提供可靠方法。
亚米尼·塔瓦德（Yamini Tawde）| 苏拉夫·达斯（Sourav Das）| 施雷娅·辛格（Shreya Singh）| 索汉·巴萨克（Soham Basak）| 萨维特里·夏尔玛（Savitri Sharma）| 阿米特·古普塔（Amit Gupta）| 阿曼吉特·巴尔（Amanjit Bal）| 希瓦普拉卡什·M·鲁德拉穆尔蒂（Shivaprakash M. Rudramurthy）| 吉蒂卡·亚达夫（Geetika Yadav）| 阿努普·高什（Anup Ghosh）
昌迪加尔医学教育与研究研究生院（PGIMER）医学微生物学系
摘要
真菌性角膜炎（FK）是一种严重的角膜感染，可能导致失明。本研究旨在开发一种双链数字PCR（ddPCR）方法，用于检测引起FK的曲霉菌（Aspergillus）和镰刀菌（Fusarium）物种，并通过评估ddPCR与qPCR的敏感性来提高诊断准确性。这项前瞻性多中心研究于2019年11月至2021年8月进行，涉及印度三个医疗机构。所有疑似FK的患者都被纳入研究。收集的部分角膜样本用于常规微生物学检测，另一部分样本用于ddPCR的标准化和验证。共有42个角膜样本用于标准化。当ct值为14.05时，750 nM浓度的曲霉菌引物显示出81.48%的最高敏感性和93.33%的特异性；而900 nM浓度的引物对镰刀菌最有效，其敏感性为80%，特异性为96.3%，对应的ct值为83.65。曲霉菌和镰刀菌的探针浓度均为250 mM。在验证组中，74个角膜样本中，曲霉菌 ddPCR的敏感性为84.21%，特异性为94.64%，镰刀菌 ddPCR的敏感性为75%，特异性为96.3%。比较分析表明，与最近报道的属特异性实时PCR相比，ddPCR在诊断曲霉菌和镰刀菌方面表现更优。因此，ddPCR作为一种快速技术，在FK诊断中具有比传统方法和qPCR更高的优势。
引言
真菌性角膜炎（FK），也称为角真菌病或眼真菌病，是一种严重的角膜感染，可能导致永久性失明甚至眼球丧失。不同国家之间FK的发病率差异很大，占所有感染性角膜炎病例的6%至53%1。遗憾的是，FK往往治疗不足，导致发病率极高2。FK在热带和亚热带地区较为常见，其发病率和地理分布在全球范围内存在差异，即使在同一国家内也是如此3。曲霉菌和镰刀菌是FK的主要致病菌，在热带和亚热带气候下尤为普遍4，而在温带地区则以念珠菌为主5。在发展中国家，从事农业或建筑相关职业的人更容易受到丝状真菌引起的FK的影响6。而在发达国家，FK的主要诱因是使用受污染的隐形眼镜7。
尽管已经明确了致病菌，但由于与其他感染性角膜炎的混淆或临床表现不典型，误诊现象仍然普遍8。传统的显微镜检查和培养方法仍是诊断的金标准，但这些方法缺乏敏感性和特异性。此外，由于抗真菌药物耐药性的增加9，及时诊断也会影响治疗效果。虽然三唑类药物对许多真菌菌株有效，但目前没有一种药物能够对抗所有导致FK的真菌10，尤其是镰刀菌引起的FK，单药治疗预后较差，需要联合治疗。因此，选择合适的抗真菌疗法取决于对感染真菌的准确鉴定11。
尽管已经开发了多种分子技术（包括聚合酶链反应（PCR）用于FK的诊断12, 13, 14，但由于测序要求和高变异性诊断性能等问题，这些技术尚未被广泛应用于临床实践10, 15。
滴液数字PCR（ddPCR）是一种创新且有前景的方法16，具有更高的敏感性和精确度，特别适用于检测低丰度样本中的病原体。该技术通过水油乳液将样本分割成约20,000个微滴，从而更准确地量化DNA模板，增强PCR的敏感性，克服抑制剂的影响，减少模板竞争，并提高多重检测能力17, 18, 19, 20。每个微滴中的扩增反应产生的累积荧光可指示目标DNA的存在17。利用泊松统计分析，阳性扩增事件和阴性扩增事件可以提供目标DNA的绝对定量，无需定量PCR（qPCR）所需的标准曲线21。
本研究的重点是为检测FK最常见的两种致病菌曲霉菌和镰刀菌开发ddPCR方案，通过评估ddPCR与qPCR的敏感性来提高FK的诊断准确性。通过利用ddPCR的精确性和敏感性，本研究旨在提供一种快速且改进的FK诊断方法，可能缩短及时使用正确抗真菌药物进行临床管理的时间。
临床样本采集与处理
2019年11月至2021年8月期间，这项前瞻性多中心研究在印度三个医疗机构进行：昌迪加尔医学教育与研究研究生院（PGIMER）的高级眼科中心（AEC）、海得拉巴的LV普拉萨德眼科研究所（LVPEI）和加尔各答的迪莎眼科医院。眼科医生按照标准程序采集了临床样本（角膜组织样本），部分样本用于
引物-探针浓度测定
对于曲霉菌和镰刀菌特异性引物，随着引物浓度的增加，拷贝数也逐渐增加。当引物浓度分别为150 nM、250 nM、350 nM和500 nM时，曲霉菌特异性引物的拷贝数分别为8600、10700、11400和100000（图1）。镰刀菌特异性引物也表现出类似的趋势：在350 nM、500 nM、750 nM和900 nM的引物浓度下，拷贝数分别为
检测限
ddPCR能够使用曲霉菌特异性引物和探针检测到黄曲霉菌（NCCPF 761989）的基因组DNA，最低检测浓度为100 fg，对应的拷贝数为1（图3A）；镰刀菌引物-探针组合能够检测到茄镰刀菌（NCCPF 580088）的基因组DNA，最低检测浓度为10 pg（图3B）。不同DNA浓度下的引物-探针拷贝数详见表2。
双链ddPCR的验证
在验证组中的74个样本中，19个样本仅通过显微镜检测呈阳性，4个样本仅通过培养检测呈阳性，35个样本通过显微镜和培养均呈阳性，16个样本两种方法均呈阴性。所有样本在培养和显微镜检测结果方面均保持盲法处理。选定的曲霉菌引物浓度为750 nM，镰刀菌引物浓度为900 nM，并在74个角膜样本中进一步进行了验证（表5）。
讨论
本研究旨在开发和评估用于诊断曲霉菌和镰刀菌引起的FK的多重ddPCR方法。我们报告了ddPCR在临床样本中的分析性能，并将其与我们之前使用曲霉菌和镰刀菌属特异性引物/探针的标准化PCR进行了比较22。研究结果表明，ddPCR的诊断性能优于
CRediT作者贡献声明
苏拉夫·达斯（Sourav Das）：撰写——审稿与编辑、验证、项目管理、方法学设计、数据分析、概念构思。
亚米尼·塔瓦德（Yamini Tawde）：撰写——初稿撰写、数据可视化、验证、方法学设计、调查、数据分析、概念构思。
阿努普·高什（Anup Ghosh）：撰写——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金获取、概念构思。
萨维特里·夏尔玛（Savitri Sharma）：撰写——审稿与编辑、数据调查
伦理批准
本研究已获得医学教育与研究研究生院机构伦理委员会的批准（批准编号：PGI/IEC/2022/001135，日期：2022年9月23日）
利益冲突声明
作者没有需要披露的相关财务或非财务利益。
资助/支持
本研究得到了印度医学研究委员会（ICMR）的新德里分部的支持（资助编号：5/4/6/14/OPH-TF/2020-NCD-II）
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务或个人关系：阿努普·K·高什（Anup K Ghosh）表示获得了印度医学研究委员会的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务或个人关系。
