《Sensors and Actuators B: Chemical》：A hepatocyte mitochondria targeting and carboxylesterase-activated probe for detection and surgical guidance of hepatocellular carcinoma resection
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肝癌早期诊断与手术导航的肝特异性线粒体靶向羧酯酶荧光探针研究。
廖永和|陈水秀|莫丹|陈小梅|魏丽芝|秦小红|黄洪|赵波|易廷庄|唐云霞
广西医科大学第二附属医院药学系，中国广西南宁530007
摘要
肝细胞癌（HCC）具有高死亡率和早期转移的倾向，因此精确的早期诊断和治疗对于改善患者预后至关重要。目前的成像技术在检测微小病变和区分良性与恶性肿瘤方面存在局限性。尽管羧酯酶（CEs）是HCC诊断的有希望的生物标志物，但现有的对CEs有响应的荧光探针往往无法同时靶向肝组织和特定细胞器。为了解决这些问题，我们开发了一种新型荧光探针LDM-CA，它具有靶向肝细胞线粒体的能力。其合理的设计包括一个胆酸部分以实现肝特异性，以及一个阳离子基团以实现线粒体定位，分子内的酯键作为对CEs有响应的位点。LDM-CA显示出对CEs的高选择性、敏感性和强结合亲和力。体外细胞实验表明，它在HCC细胞中对线粒体具有出色的靶向性，并能特异性地响应细胞内的CEs，从而能够清晰地区分HCC细胞和正常细胞。此外，在小鼠模型中的体内成像显示，LDM-CA能够在肿瘤内或静脉注射后有效可视化皮下HCC并勾勒出肿瘤边缘，突显了其在指导精确手术切除方面的巨大潜力。本研究不仅确立了LDM-CA作为早期HCC诊断和图像引导手术的强大分子工具的地位，还为研究线粒体CEs活性在HCC发病机制中的亚细胞水平作用提供了有价值的手段。
引言
肝细胞癌（HCC）是一种高度侵袭性的肝脏恶性肿瘤，是全球最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]、[2]、[3]。由于其强烈的侵袭性和早期转移倾向，大多数HCC患者在晚期才被诊断出来，导致预后较差[4]、[5]。目前，临床实践依赖于计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）和超声检查（US）等成像技术来检测肝脏局灶性病变[6]、[7]。虽然这些方法在肝癌诊断中发挥了重要作用，但仍存在某些局限性[8]。具体来说，它们在识别直径小于1厘米的小病变方面灵敏度较低，且经常无法可靠地区分良性再生结节和恶性肿瘤。因此，一些早期HCC病例未能被检测到或被误诊。此外，当前的成像方法无法提供肿瘤生物活性的实时评估，从而无法满足临床对精确诊断、治疗反应动态监测和手术切除指导的需求[8]。因此，迫切需要开发具有高特异性和灵敏度以及实时监测能力的新HCC诊断工具。
在医学诊断领域，生物标志物为HCC的精确诊断提供了有希望的方向。在HCC的发展和进展过程中，肝脏特异性生物标志物表达水平的变化可以直接反映肝细胞的恶性转化[9]。其中，羧酯酶（CEs）由于其独特的组织分布和功能特性，已成为HCC的高潜力诊断生物标志物[8]、[10]。CEs是主要富集在肝脏中的水解酶，它们在肝脏组织中的丰富存在使其成为评估肝功能及诊断肝脏相关疾病（包括HCC）的重要生物标志物[11]。CEs的表达水平与肝癌的恶性程度密切相关，其异常调控可能直接参与肝癌的发生[12]。早期检测CEs的方法存在显著局限性。如qRT-PCR和Western blot等技术可以量化蛋白质表达，但灵敏度和选择性有限，容易受到复杂样本中内源性干扰物的影响，且无法反映实际的酶活性[7]、[10]。相比之下，紫外分光光度法、毛细管电泳和液相色谱可以测定酶活性，但通常无法进行体内实时监测[11]、[13]、[14]、[15]、[16]。因此，开发高灵敏度和特异性的体内CEs活性检测方法具有重要意义，为肝癌的早期诊断、疾病严重程度的评估和手术切除指导提供了潜在工具。
荧光探针技术能够以高灵敏度和特异性实时可视化细胞和分子事件，显示出克服传统诊断方法局限性的巨大潜力[17]、[18]、[19]、[20]。它甚至可用于肿瘤病变的图像引导手术切除[21]、[22]、[23]、[24]。它已成为研究与HCC相关的分子事件和病理状态的重要工具[17]。近年来，尽管报道了许多用于检测CEs的荧光探针，但现有探针仍存在一些缺点。例如，大多数CEs探针的识别基团主要基于酯键，这可能导致与乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的底物发生交叉反应，从而影响CEs活性检测的准确性[11]、[12]、[25]。此外，这些探针对肝组织的特异性不足也是一个主要限制[11]、[21]、[26]。当前CEs检测方法的一个主要挑战是缺乏靶向特异性[8]。酯键在各种组织和器官中的广泛存在可能导致脱靶效应，降低肝脏成像的精度。这种缺乏特异性会削弱肝脏疾病诊断的准确性，因为信号可能来自非肝脏组织，导致假阳性或误导性的结果[27]。因此，迫切需要开发具有肝脏特异性靶向性的酶响应荧光探针，以提高肝脏疾病诊断的精确性和准确性。
胆酸是一种在多种肝脏相关通路中起关键信号作用的分子，对肝细胞具有独特的亲和力，可以促进其向这些细胞的靶向递送[28]。一些探针经过胆酸基团的修饰，以增强其对肝脏组织的特异性结合能力，从而减少脱靶效应并提高肝脏成像的准确性和可靠性[28]、[29]、[30]。初步实验结果表明，这类新型探针在肝细胞中显著增强了荧光信号，为肝脏疾病的早期诊断和治疗监测提供了有希望的工具[29]、[30]。然而，这些探针通常结构复杂，合成难度大，其在CEs检测中的应用仍然相对有限。值得注意的是，胆酸在结构上类似于某些三萜酸，这些三萜酸能抑制CEs，从而比基于苯基或乙酰酯的传统识别单元具有更高的亲和力[28]、[31]。利用这一特性，可以通过将胆酸与荧光团结合来构建用于CEs检测的新探针。这种策略不仅提高了探针对CEs的选择性，还利用了胆酸固有的肝脏靶向能力，实现探针在肝脏组织中的特异性富集。迄今为止，同时响应CEs和靶向肝脏的双功能探针仍然很少见，而那些还能靶向亚细胞器探针则更为罕见。
除了组织水平靶向外，许多CEs激活的荧光探针普遍缺乏细胞器特异性设计，这限制了它们的广泛应用价值。线粒体被称为细胞的“动力源”，在能量代谢、凋亡和氧化还原调节中起着核心作用[32]、[33]、[34]。线粒体功能障碍与多种疾病（包括癌症）的发病机制密切相关[35]、[36]、[37]。研究表明，线粒体酯酶活性可能参与调节与凋亡相关的信号分子或应激反应[38]、[39]。因此，靶向线粒体在HCC的诊断和治疗中具有重要意义，因为它有助于阐明HCC等癌症发生、进展和耐药性过程中线粒体特异性CEs活性的异常变化和功能[40]。然而，能够准确检测线粒体酯酶活性的荧光探针仍然很少[40]。线粒体内膜两侧显著的负电位为脂溶性阳离子介导的线粒体靶向提供了天然机制。阳离子基团可以通过静电相互作用在线粒体基质中积累，并表现出持久的保留能力，从而实现精确的探针定位[32]、[34]。因此，开发具有双重肝脏和线粒体靶向能力的CEs荧光探针不仅可以提高HCC诊断的特异性，还可以揭示HCC发病机制中异常线粒体CEs活性的作用，为理解肿瘤细胞中的代谢重编程提供新的视角。
基于这一背景，本研究旨在开发一种新型的肝细胞线粒体靶向CEs激活的荧光探针LDM-CA。通过加入胆酸基团以实现肝脏靶向能力，并利用脂溶性阳离子实现精确的线粒体定位，LDM-CA有望实现对肝脏组织内CEs活性的特异性、高灵敏度、实时和原位动态监测，特别是在肝细胞线粒体中（图1）。LDM-CA有望为HCC的早期诊断和精确分期提供新方法，为肿瘤病变的准确手术切除提供指导，并作为阐明HCC发展过程中CEs功能机制的强大工具。
合成与表征
LDM-CA的合成路线如图1[41]、[42]所示。所有化合物的结构均通过1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱（HRMS）进行了表征。
体外条件下LDM-CA对CEs的响应与检测
首先在体外系统中评估了LDM-CA对CEs的响应性能。如图2a所示，加入CEs后，LDM-CA在557 nm处显示出明显的紫外吸收峰。荧光测量进一步表明，在没有CEs的情况下，LDM-CA溶液几乎不发光；而与CEs孵育后，荧光信号逐渐在633 nm处出现（图2b）。随着CEs浓度的增加，荧光强度稳步增强。
结论
总结来说，我们开发了一种具有肝细胞线粒体靶向能力的CEs激活探针，实现了HCC中的精确检测、动态监测和手术指导。LDM-CA的设计非常合理：胆酸作为肝脏靶向部分，阳离子基团实现线粒体定位，分子内的酯键作为特异性响应位点。该探针对CEs表现出高选择性和敏感性，分子对接模拟进一步证实了这一点。
CRediT作者贡献声明
黄洪：研究、数据管理。
秦小红：研究、数据管理。
易廷庄：撰写-审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、研究、资金获取。
赵波：撰写-审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、研究、资金获取。
莫丹：验证、研究、数据分析、数据管理。
陈水秀：验证、研究、数据管理、概念构思。
魏丽芝：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了广西自然科学基金（编号：2024JJH140190）、广西高校中青年教师能力提升研究基金（编号：2021KY0558）和国家自然科学基金（编号：8246047）的资助。此外，广西医科大学药学院和附属医院提供了实验室空间和设备等支持。
廖永和于2025年获得广西医科大学硕士学位，目前在该校第二附属医院药学系工作。他的研究兴趣集中在开发用于诊断和治疗应用的新型荧光探针上。
