《Analytical Biochemistry》：Engineering GFP–NanoLuc Fusion Substrates for Sensitive, Quantitative Detection of Protease Activity via BRET
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本研究开发了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的通用蛋白酶检测系统，通过将NanoLuc（NLuc）与绿色荧光蛋白（GFP）融合并嵌入可切割肽序列，实现实时、灵敏的蛋白酶活性监测。优化后，TEV蛋白酶的检测限达0.0426 μM，而替换为caspase-3特异性序列的检测限提升至0.62 nM，且无需化学合成即可在大肠杆菌中表达。
Mitsuki Nakamura | Masafumi Sakono
富山大学工学院应用化学系，日本富山县富福3190，邮编930-855
摘要
蛋白酶在多种生物过程中发挥着重要作用，并与多种疾病密切相关，因此成为诊断和治疗开发的重要靶点。传统的蛋白酶活性测定方法通常依赖于需要有机合成的显色或荧光底物，这增加了生产成本并限制了其应用范围。为了解决这些问题，我们开发了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的蛋白酶底物，该底物由NanoLuc（NLuc）和绿色荧光蛋白（GFP）组成，这两种蛋白分别融合在可切割肽序列的两端。在完整的融合蛋白中，NLuc的发光通过BRET激发GFP，产生绿色荧光；而蛋白酶的切割会破坏BRET效应，从而降低GFP的荧光强度。以烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶为模型，我们证明了在切割位点两侧引入甘氨酸-丝氨酸连接剂（TEVcs）可以提高蛋白酶的可切割性和信号响应性。优化后的底物能够定量检测TEV蛋白酶的活性，检测限为0.0426 μM。此外，将TEVcs替换为caspase-3特异性序列后，可以灵敏地检测caspase-3的活性，检测限为0.62 nM。该系统利用标准的大肠杆菌表达系统，提供了一种经济高效且应用广泛的实时蛋白酶活性测量方法，无需使用化学合成的底物。
引言
蛋白酶是一类能够识别并切割多肽中特定肽键的酶，在信号转导、免疫反应和细胞凋亡调控等多种生理过程中发挥着关键作用[1]、[2]。蛋白酶活性的失调与多种疾病有关，如癌症、神经退行性疾病和传染病等。因此，蛋白酶既是疾病诊断的重要靶点，也是药物发现的关键目标[3]、[4]、[5]。蛋白酶抑制剂因其能够通过与底物结合位点或催化结构域结合来抑制酶活性而受到广泛关注[6]、[7]、[8]、[9]。
为了研究蛋白酶的病理作用并评估其抑制剂的效力，开发出高效且灵敏的蛋白酶活性测定方法至关重要。传统的方法通常使用显色或荧光底物，这些底物包含特定于某种蛋白酶的短肽序列，与报告分子（如
-硝基苯胺、7-氨基-4-甲基香豆素或7-氨基-4-三氟甲基香豆素）结合。当蛋白酶进行切割时，这些底物会释放荧光团或发色团，从而可以通过分光光度法或荧光法进行活性定量[10]、[11]、[12]。
基于荧光共振能量转移（FRET）的底物已被广泛用于蛋白酶活性测定[14]。这类系统利用位于蛋白酶底物两端的供体和受体荧光团；当底物保持完整时，能量从激发的供体传递给受体，产生特征性的荧光信号；而蛋白酶切割会破坏FRET效应，导致荧光强度或波长的变化[15]、[16]、[17]。尽管FRET方法有效且应用广泛，但需要外部激发光源，这可能会引起细胞自荧光和光漂白[18]。此外，底物的合成往往涉及复杂的有机化学反应，增加了生产成本并限制了其应用范围。
为了解决这些限制，我们探索了基于生物发光共振能量转移（BRET）的策略。BRET是一种非辐射性的能量传递现象，其中生物发光供体（通常是荧光素酶）将能量传递给荧光受体[19]。与FRET不同，BRET不需要外部光源，从而减少了背景信号和光毒性[20]。此外，由于BRET底物可以完全由基因编码的蛋白质构成，因此可以在大肠杆菌中生产，无需化学合成，从而提供了一种经济高效且可扩展的蛋白酶活性测定方法。基于共振能量转移的蛋白酶测定方法（包括FRET和BRET格式）已使用多种报告分子和切割肽序列进行了广泛研究。Dacres等人报道的BRET基蛋白酶生物传感器就是一个典型例子[21]，该传感器针对特定细菌蛋白酶和样品基质进行了优化。这些研究表明，测定性能不仅取决于切割序列，还取决于融合结构——即报告分子的排列方式以及切割基序的呈现方式，这些因素共同决定了蛋白酶的可切割性和信号变化的幅度。
在这项工作中，我们旨在利用NanoLuc（NLuc）/GFP对构建一个可工程化且通用的BRET底物框架。我们的主要贡献包括：（i）利用NLuc作为紧凑且高亮度的供体，实现重组融合蛋白的灵敏检测；（ii）系统地设计切割基序两侧的连接结构，以提高蛋白酶的可切割性和测定响应性，从而提供实用的设计指导；（iii）通过用其他识别基序替换嵌入的蛋白酶切割序列，同时保持整体融合结构和测定流程不变。
在本研究中，我们设计了一种基于BRET的蛋白酶底物，其中NLuc和GFP分别融合在短蛋白切割位点的C端和N端。NLuc是一种来自深海虾的荧光素酶，在氧化coelenterazine衍生物（如furimazine或bis-coelenterazine（BisZ）时会产生强烈的蓝色荧光（λmax = 460 nm）[22]。其紧凑的体积减少了与蛋白酶相互作用的干扰，促进了能量传递效率。GFP最初从Aequorea victoria中分离得到，它在398 nm和475 nm处吸收光，并在大约510 nm处发出绿色荧光，这与NLuc的发射波长重叠，适合作为BRET受体。
在完整的融合蛋白中，NLuc的发光通过BRET激发GFP，产生绿色荧光；当插入的序列被蛋白酶切割后，NLuc和GFP分离，BRET效应被破坏，GFP的荧光强度降低。因此，可以通过测量荧光强度的变化实时监测切割程度。在本研究中，我们使用两种模型蛋白酶（TEV蛋白酶[23]和caspase-3[24]）验证了该平台的有效性，证明了基于BRET的底物设计具有广泛的应用性和高度适应性。
包含TEV蛋白酶切割位点（TEVcs）的GFP–NLuc融合蛋白的制备
为了构建含有TEV蛋白酶切割位点（TEVcs）的GFP–TEVcs–NanoLuc融合蛋白，我们采用了三步In-Fusion克隆策略，使用pH6HTN His6-HaloTag T7载体（Promega）作为骨架。首先，使用具有15 bp重叠序列的引物将NanoLuc荧光素酶基因（NLuc；Promega）插入线性化的载体中；接着，在NLuc上游插入GFP基因；最后，在GFP和NLuc之间引入编码蛋白酶切割位点的序列。
引入的序列如下：
结果与讨论
图1(a)展示了基于BRET的蛋白酶响应性底物的概念设计和初步验证，以TEV蛋白酶为模型。融合蛋白的N端是GFP，C端是NLuc，两者之间插入了TEVcs。由于该构建体作为单一融合蛋白表达，因此可以使用标准大肠杆菌表达系统轻松生产。当加入NLuc底物BisZ时，NLuc会发出荧光，从而激发...
结论
在这项研究中，我们开发了一种基于GFP和NLuc之间BRET的多功能蛋白酶检测系统。通过在两个报告分子之间插入特定于蛋白酶的切割序列，我们创建了能够定量检测蛋白酶活性的融合蛋白底物。以TEV蛋白酶为模型，我们证明了在切割位点两侧引入灵活的甘氨酸-丝氨酸连接剂对于高效的蛋白酶切割和BRET信号干扰至关重要。
CRediT作者贡献声明
Mitsuki Nakamura：撰写——原始草稿、数据可视化、实验研究。Masafumi Sakono：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、方法学设计、实验研究、概念构思
致谢
本工作得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究资助计划（KAKENHI）（项目编号：25K08397）的支持，同时也得到了日本科学技术机构（JST）“下一代启动的先锋研究”（SPRING）计划（项目编号：JPMJSP2145）的支持。
