《International Immunopharmacology》：Investigating the mechanism by which telomere dysfunction affects mitochondrial homeostasis in anthracosilicosis using a Terc knockout model
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煤矽肺（anthracosilicosis）病理机制涉及端粒功能障碍与线粒体稳态失衡的协同作用。本研究构建Terc基因敲除小鼠联合煤矽混合粉尘暴露模型，通过组织病理学分析、线粒体超微结构观察及分子检测，发现粉尘暴露加速端粒缩短并破坏线粒体动态平衡，导致氧化应激加剧、ATP合成减少和肺纤维化加重。Terc缺失不仅加重上述损伤，还抑制端粒酶逆转录酶（TERT）向线粒体的转位，进一步削弱抗氧化能力。该研究揭示了端粒-线粒体轴在煤矽肺纤维化中的调控机制，为精准防治提供理论依据。
邱秋芳|张一鸣|周清楠|郭书涵|周强|常美玉|何振林|刘乐|王宇科|李静|曹红|赵向伟|李志恒|姚三桥
河南医科大学公共卫生学院，中国新乡453003
摘要
煤硅肺病是一种煤工尘肺病，其病理特征同时具有煤工尘肺病和矽肺病的特点。其发病机制尚未完全明了。越来越多的证据表明，端粒功能障碍和线粒体稳态在肺纤维化的发生中起着关键作用。本研究利用端粒酶RNA成分（Terc）敲除小鼠模型，探讨了端粒功能对线粒体稳态的调节作用及其对煤硅肺病的影响。通过建立Terc敲除小鼠和煤硅肺病小鼠模型，分析了端粒功能对线粒体稳态的影响。采用H&E染色和Masson染色对肺组织进行组织病理学分析，通过免疫荧光检测COL1a1和COL1a3的沉积情况，利用定量荧光原位杂交（Q-FISH）和qPCR测量端粒长度，并通过免疫荧光共定位观察端粒酶逆转录酶（TERT）在线粒体中的亚细胞定位。通过透射电子显微镜（TEM）评估线粒体超微结构变化，通过ELISA和铁还原抗氧化能力（FRAP）测定氧化应激水平，通过Western blot和qPCR分析六种端粒结合蛋白和线粒体稳态相关标志物的表达水平。与对照组和暴露于煤硅尘（CSD）的野生型小鼠相比，Terc-/-对照组和Terc-/-CSD暴露小鼠的端粒显著缩短，六种端粒结合蛋白的表达严重失调，端粒功能障碍加剧。这些小鼠还表现出氧化损伤增加、线粒体形态和数量异常、ATP水平显著降低以及线粒体动态平衡紊乱。我们的发现表明，煤硅尘暴露会加重Terc-/-小鼠的端粒缩短和线粒体稳态紊乱，从而导致肺纤维化加剧，促进煤硅肺病的发生和发展。这些结果为制定精确的尘肺病预防和治疗策略提供了有价值的见解。
引言
煤工尘肺病（CWP）是一种由长期吸入煤尘引起的职业性肺病，其特征是慢性炎症、进行性肺纤维化和肺功能丧失[1]。尽管职业防护措施不断改进，但全球煤硅肺病的发病率仍然很高，特别是在发展中国家，大约10-20%的矿工最终会发展成不可逆的肺纤维化[2]。肺纤维化的核心病理机制包括肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞异常激活和细胞外基质过度沉积[3]；然而，其分子调控网络尚未完全阐明。近年来，关于衰老相关疾病的研究表明，端粒功能障碍和线粒体稳态失调与多种纤维化疾病（包括特发性肺纤维化（IPF）和肝纤维化）密切相关[4]。然而，这两种生物学过程之间的相互作用及其在煤硅肺病中的具体机制仍不清楚。本研究旨在利用煤硅肺病小鼠模型和端粒酶RNA成分敲除（Terc-/-）小鼠模型，系统探讨端粒功能障碍调节线粒体稳态的动态关系和分子机制，为制定针对性干预策略提供新的见解。
端粒是位于染色体末端的核蛋白复合体，由串联的TTAGGG重复序列和shelterin蛋白复合体组成。该复合体包括端粒重复结合因子1（TRF1）、端粒重复结合因子2（TRF2）、端粒保护蛋白1（POT1）、抑制/激活蛋白1（RAP1）、TRF1相互作用核因子2（TIN2）和TIN2-POT1相互作用蛋白1（TPP1）[5]。端粒长度的维持严重依赖于端粒酶活性[6]。端粒缩短或shelterin蛋白表达失衡可引发端粒功能障碍，激活p53/p21或p16/RB通路，导致细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（SASP）[7]。特发性肺纤维化（IPF）患者的肺泡上皮细胞端粒显著缩短，端粒酶突变携带者的肺纤维化风险增加3-5倍[8]。值得注意的是，端粒功能障碍不仅直接诱导细胞衰老[9]，还通过线粒体-核通讯干扰能量代谢[10]。例如，端粒缩短会抑制过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达[11]，导致线粒体ATP生成减少、活性氧（ROS）积累和氧化损伤加剧[12]。然而，目前尚不清楚煤硅尘暴露是否加速端粒磨损从而损害线粒体功能，或者这两种过程如何协同促进纤维化。
线粒体是细胞能量生产和代谢的中心枢纽，其稳态依赖于三个关键过程的精确调控：生物发生、动态变化（融合/分裂）和质量控制（线粒体自噬）[13]。在肺纤维化进展过程中，肺泡II型（AT2）细胞和成纤维细胞的线粒体功能存在显著差异：（1）AT2细胞的线粒体膜电位降低，ATP合成减少，线粒体DNA（mtDNA）突变积累，导致细胞修复能力受损；（2）而激活的成纤维细胞则表现出糖酵解增强（Warburg效应）和线粒体分裂蛋白FIS1上调，以满足增殖和胶原蛋白生成的能量和生物合成需求[14]。先前的研究证实，线粒体动态失衡（如由optic atrophy 1（OPA1）介导的融合缺陷或由PTEN诱导的putative kinase 1（PINK1）/Parkin通路介导的线粒体自噬损伤）是纤维化微环境中活性氧（ROS）积累的关键因素[15]。然而，尚不清楚在线粒体暴露条件下（如煤硅肺病），线粒体稳态是否直接受端粒功能状态调控[16]。
最近的研究表明，端粒功能障碍可能通过表观遗传调控、氧化应激和代谢重编程等机制干扰线粒体稳态[[16]，[17]，[18]]。值得注意的是，端粒酶逆转录酶（TERT）在应激条件下可转移到线粒体，通过减少ROS生成和增强抗氧化能力发挥保护作用[19,20]。在矽肺病的背景下，线粒体损伤和先天免疫激活与疾病进展有关[21]。然而，尚不清楚端粒缩短是否损害TERT的线粒体转移和保护功能，从而加剧煤硅肺病的纤维化。此外，端粒功能障碍和线粒体稳态在职业性煤硅肺病发病机制中的作用及其潜在的调控机制仍不清楚。本研究旨在揭示端粒介导的线粒体调节在煤硅肺病发病机制中的作用，从而为理解煤工尘肺病提供关键见解。
为了解决这些问题，我们建立了Terc-/-小鼠模型，并结合煤硅尘暴露系统，以阐明端粒功能、线粒体稳态和纤维化进展之间的时间关系。进行了多层次评估，包括线粒体超微结构（通过透射电子显微镜观察嵴形态）、功能指标（ATP生成、8-OHdG、SOD2活性）和分子分析（端粒结合蛋白和线粒体调节因子的表达）。
化学物质和抗体
硅颗粒（纯度>99%），平均粒径范围为0.5–10 μm，购自Sigma-Aldrich（中国上海）。煤尘由大同煤矿集团有限公司（中国山西）提供，平均粒径范围为2.4至3.7 μm。所有颗粒在使用前均经过研磨和灭菌。
以下是一级抗体，均来自Proteintech Group Ltd.，均为兔源抗体，除非另有说明，使用稀释度为1:1000：
暴露于煤硅混合粉尘的小鼠的病理肺变化
根据先前的实验方案，在两个时间点（56天和84天）建立了煤硅肺病模型。H&E染色显示，与Con组相比，CSD暴露小鼠的肺泡结构更加紊乱，伴有大量炎症细胞浸润、纤维化结节形成和严重的纤维化。Masson三色染色显示胶原染色区域显著增加，胶原沉积丰富。
讨论
煤硅肺病是一种常见且严重的职业性肺病，其发病机制涉及多种因素和途径的复杂相互作用，尚未完全阐明[19]。通过建立Terc基因敲除（Terc?/?）小鼠模型并结合煤硅尘暴露，我们首次系统揭示了端粒功能障碍的协同作用和分子机制。
结论与未来展望
本研究通过构建Terc?/?小鼠模型和煤硅肺病模型，系统阐明了端粒功能障碍和线粒体稳态失衡在煤硅肺病发病机制中的协同作用。我们发现，煤和硅尘暴露会诱导氧化损伤和端粒功能障碍。TERC的缺失不仅加剧了这些变化，还损害了TERT的线粒体转移，导致线粒体质量受损
CRediT作者贡献声明
邱秋芳：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，软件使用，实验设计，数据管理。张一鸣：项目管理，实验设计。周清楠：项目管理，实验设计。郭书涵：项目管理，方法学。周强：项目管理，实验设计。常美玉：方法学，数据分析。何振林：软件使用。刘乐：软件使用。王宇科：软件使用。李静：方法学。曹红：方法学。赵向伟：资源提供，
资助
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号[82373544]）的支持。
利益冲突声明
作者声明以下可能的财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：姚三桥报告称获得了国家自然科学基金的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
