《International Immunopharmacology》：Deficiency of inducible nitric oxide synthase alleviates dermal fibrosis and inflammation in scleroderma
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系统性硬化症（scleroderma）的进展与纤维细胞（FBs）激活及胶原沉积密切相关，而免疫细胞（如角质形成细胞KCs、中性粒细胞Neus）的异常相互作用起关键作用。本研究通过BLM诱导的狼疮模型，证实iNOS缺失显著减轻炎症反应和纤维化程度，抑制KCs和Neus浸润及促炎因子表达，同时阻断iNOS可缓解皮肤硬化。研究揭示了iNOS在KCs中驱动炎症和纤维化的核心机制，为靶向治疗提供依据。
Jing Luo|明伟李|戴赵|洪晨| Junkai Huang| 孟珂孙| 千宇朱| 齐国| 季成宋| 千树元| 惠莉| 冯通李| 英希李| 宾欣张| 龙苏| 韦斌星| 李志华
天津医科大学免疫微环境与疾病重点实验室（教育部），中国天津300070
摘要
硬皮病是一种以慢性炎症和进行性皮肤纤维化为特征的结缔组织疾病。成纤维细胞（FBs）的异常激活以及胶原蛋白在细胞外基质（ECM）中的沉积是硬皮病进展的关键因素。虽然成纤维细胞的激活已被认为与角质形成细胞（KCs）和免疫细胞的功能障碍有关，但这些细胞之间的相互作用对于硬皮病的进展至关重要。最新研究表明，可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）在硬皮病病变中高度表达，并且iNOS促进了皮肤病的进展。然而，iNOS在硬皮病中的具体作用仍有待进一步阐明。我们利用博来霉素（BLM）诱导的硬皮病模型在野生型（WT）和iNOS敲除（iNOS KO）小鼠中研究了iNOS的功能。我们发现，iNOS的缺乏可以缓解硬皮病的进展，通过抑制角质形成细胞和中性粒细胞（Neus）的炎症因子表达来实现。随后，我们用主要由角质形成细胞和中性粒细胞产生的TNF-α和IL-1β刺激成纤维细胞，确认iNOS的缺失会减弱成纤维细胞的激活。我们还发现，iNOS抑制剂显著减轻了硬皮病病变的严重程度。我们的研究共同揭示了iNOS在硬皮病中的关键作用，强调了其作为治疗靶点的潜力。
引言
硬皮病是一种自身免疫性结缔组织疾病，其特征是皮肤和多个器官的慢性炎症和进行性纤维化[1]。成纤维细胞（FBs）的异常激活是硬皮病发病机制中的关键事件，这导致了细胞外基质（ECM）的过度沉积[2,3]。越来越多的证据表明，免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等）通过分泌各种氧化应激因子和炎症介质来维持慢性炎症，从而促进成纤维细胞的激活[4]。例如，Ha Yeon Jeong等人强调了Th17极化在硬皮病发病机制中的重要作用，证明它通过IL-17调节成纤维细胞的激活[5,6]。Theresa C Barnes等人也发现中性粒细胞（Neus）产生过多的活性氧（ROS），触发硬皮病中的成纤维细胞激活[7]。近年来，多项研究还表明角质形成细胞（KCs）在调节成纤维细胞激活中起着不可或缺的作用[8,9]。Ruirui Wu等人表明，角质形成细胞中核因子E2相关因子2（Nrf2）的缺失会加剧炎症反应和皮肤纤维化[10]。作为经典的硬皮病模型诱导剂，BLM在角质形成细胞中引起的反应比在成纤维细胞中更为明显[11]。这些结果表明，角质形成细胞通过分泌各种旁分泌因子参与成纤维细胞的激活，从而加重皮肤纤维化的进展[8,9,12]。总体而言，现有证据强调了细胞间相互作用在调节硬皮病成纤维细胞激活中的重要性。
最近的研究强调了可诱导的一氧化氮合酶（iNOS）及其产物一氧化氮（NO）在皮肤生物学中的关键调控作用[13]。研究表明，iNOS是皮肤炎症和疤痕形成过程中多种细胞功能的关键调节因子。Young-Jin Lim等人在带状疱疹患者和Ines K?hler在银屑病患者中报告的角质形成细胞中iNOS表达升高是皮肤炎症进展的重要因素[14,15]。Padmini Jayaraman和Monika Vig等人也阐明了iNOS在调节免疫细胞功能中的关键作用[16,17]。同时，iNOS调节成纤维细胞的胶原蛋白合成，促进了肥厚性疤痕和瘢痕疙瘩的发病[18]。大量研究表明，iNOS驱动的细胞间相互作用通过调节炎症介质来调控疾病进展[19,20]。iNOS对多种皮肤细胞功能至关重要，在硬皮病病变中显著上调[21]，支持了其在硬皮病发病机制中的关键作用。
基于这些发现，我们假设iNOS显著促进了硬皮病的进展。因此，本研究旨在阐明其机制，从而确定iNOS作为硬皮病的潜在治疗靶点。
实验动物
实验动物
iNOS敲除（iNOS KO）小鼠由加州大学旧金山分校的Bikle博士提供[22]。野生型（WT）C57BL/6 J小鼠从Spefu（北京）生物技术有限公司获得。八周大的雌性小鼠被饲养在天津医科大学的动物设施中，处于无特定病原体（SPF）条件下，环境温度为25°C，相对湿度为50%，光照/黑暗周期为12小时。我们的研究检测了雄性和雌性动物，结果相似
iNOS缺乏可缓解BLM诱导的硬皮病
为了研究iNOS在硬皮病进展中的作用，我们首先评估了其在博来霉素诱导的病变中的表达情况。iNOS在真皮和表皮中显著升高并广泛表达（图1A和B）。使用iNOS敲除（iNOS KO）小鼠，我们发现iNOS的缺乏减少了硬皮病病变中的真皮/表皮厚度、炎症反应程度和胶原蛋白沉积（图1C）。对表皮/真皮厚度的定量分析证实了这一点
讨论
我们的研究表明，iNOS的缺乏减轻了硬皮病中的炎症和纤维化。我们进一步确定角质形成细胞中的iNOS是驱动BLM诱导的皮肤炎症和纤维化的核心因素。此外，iNOS通过增强中性粒细胞的浸润和调节关键细胞因子及趋化因子的表达来持续组织炎症。最后，iNOS抑制剂在显著缓解硬皮病方面的治疗潜力得到了证实
作者贡献声明
Jing Luo：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、数据分析。Mingwei Li：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究。Di Zhao：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究。Hong Chen：数据分析。Junkai Huang：数据分析。Mengke Sun：项目管理、方法学。Qianyu Zhu：项目管理、方法学。Qi Guo：监督、软件支持。Sicheng Song：
资金来源
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82273563、81972962（给L.H.）；82304025（给YX L））的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢天津医科大学病原生物学与免疫学系的Ruitan Guo、Chenxi Li和Jingyu Zhang对本文的宝贵贡献。
