《mAbs》：Systematic review and data-driven insights into CHO cell engineering for next-generation antibody production
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本综述对2011-2024年间164篇研究CHO细胞工程以提高重组蛋白产量的文献进行了系统性回顾与定量分析，涵盖了466个工程化靶点。文章揭示了该领域从简单过表达向CRISPR介导的基因敲除等组合策略的演变，指出针对核内、表观遗传及凋亡/增殖相关靶点的工程化能获得最大收益。尽管技术进步显著，但报道的产量提升倍数保持稳定，凸显了基于通路认知的多靶点工程化必要性。综述为支持下一代生物治疗药物生产的理性CHO细胞设计提供了数据驱动框架，并强调了标准化模型和结构化数据集对未来预测模型发展的重要性。
摘要
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞仍然是治疗性抗体和生物制药生产的主要平台，但生产力瓶颈依然存在，尤其是在生产复杂分子时。为了识别宿主细胞优化的总体趋势，本研究对2011年至2024年间报告的164篇关于CHO细胞工程策略及其对滴度或比生产率影响的出版物进行了系统性回顾和定量交叉研究分析。研究人员提取并分析了来自466个工程化靶点的数据，按策略、通路和生产背景进行分类。该领域主要由抗体生产驱动，已从简单的过表达发展为CRISPR介导的基因敲除，而组合方法以及对核内、表观遗传和凋亡/增殖靶点的工程化实现了最大的增益。尽管技术进步，报道的改善倍数保持稳定，突显了基于通路认知的多靶点工程化的必要性。工程策略预测模型的未来进展将取决于标准化模型和结构化数据集。本综述为支持下一代生物治疗药物生产的理性CHO细胞设计提供了一个数据驱动的框架。
引言
自1986年首个治疗性重组蛋白组织纤溶酶原激活剂（tPA）获批以来，市场和治疗性蛋白产品组合呈指数级增长，到2021年全球销售额超过3400亿美元。单克隆抗体（mAb）作为最成功和占主导地位的生物治疗药物类别，为癌症和自身免疫性疾病等复杂疾病提供了新的靶向治疗选择。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系已成为治疗性重组蛋白生产的主要宿主系统，因为它们能够产生具有翻译后修饰（PTM）的复杂蛋白，并且具有鲁棒性、适应悬浮培养和抗病毒感染能力。因此，截至2021年，89%的哺乳动物来源产品和60%的所有获批的重组治疗药物是在CHO细胞中生产的。在过去的四十年里，优化CHO细胞生产一直是主要的研究重点，导致重组蛋白滴度和比生产率（qp，例如，皮克/细胞/天）显著提高。尽管取得了这些进展，但与细菌或酵母培养相比，CHO细胞像其他哺乳动物表达系统一样，在生产产量、可达到的细胞密度和培养时间方面仍然有限。因此，提高CHO细胞中的重组蛋白生产仍然是实现成本效益高的生物制药制造的关键挑战。
2011年CHO基因组测序完成是一个转折点，使得新的基因工程和筛选策略成为可能。然而，这些新策略是否显著提高了CHO细胞的生产力，以及哪些工程靶点、靶向通路或工程策略最有效，目前尚缺乏全面的理解。一项综合的交叉研究分析，汇总大量个体报告和工程靶点的结果，有助于填补这一知识空白，并为未来的CHO细胞工程工作提供信息。
文献检索与筛选方法
本综述的方法学遵循系统性综述的原则，包括三个主要阶段：识别相关数据库、制定全面的搜索策略并执行搜索；基于预定义的纳入和排除标准进行标题和摘要筛选；对确定的出版物进行全文审查并选择相关文献。搜索策略围绕三个核心概念构建：CHO细胞、重组生物制药蛋白生产和细胞工程。最终，通过筛选确定了164篇描述CHO宿主细胞工程方法并对生产力有影响的原始出版物，并从这些报告中手动提取了每个报告的工程靶点的关键性能数据。
数据集特征与主要发现
对164篇出版物的分析显示，约三分之二（62%）的报告涉及mAb生产，约五分之一（18%）涉及其他治疗性蛋白的生产。在工程机制方面，过表达（OEX）是最常用的方法（63%的出版物），其次是基因敲除（KO，19%）和基因敲低（KD，14%）。就靶向的通路或细胞机制而言，工程化策略靶向广泛的细胞通路和机制，包括凋亡或增殖、代谢、未折叠蛋白反应（UPR）/内质网（ER）/高尔基体/PTM、翻译、转录因子（TF）、表观遗传修饰剂以及非编码RNA（ncRNA）等。其中，组合靶向不同通路的工程化策略以及针对表观遗传、凋亡/增殖通路的干预显示出更高的中位改善倍数。
在亚细胞定位方面，约三分之一的研究报告了细胞质靶点，五分之一针对核内靶点。大约一半（51%）的过表达研究使用CHO来源的靶点编码序列（CDS）。大多数出版物（65%）报告了稳定的靶点工程，这反映了工业生产的金标准。从作者隶属关系来看，约48%的出版物源自学术机构，40%由学术界和工业界合作撰写，12%仅由工业界撰写。2011年至2024年间，每年发表的CHO细胞工程相关出版物数量呈增长趋势。
分析所有466个工程化靶点，其中位改善倍数为1.6倍。按时间分组后，中位改善倍数从2011-2013年的2.1倍下降到2020-2022年的1.5倍，这可能与评估的靶点数量大幅增加有关。在报告的靶点中，大多数（87%）仅在单一出版物中被描述，而一小部分（13%）出现在多个报告中。最常报告的靶点包括转录因子（如XBP1s、Blimp1）、凋亡/增殖调节因子（如BAK、BAX、Bcl-xL）、内质网/高尔基体/UPR蛋白（如BIP、PDI）以及非编码RNA（如miR-17）。
工程化方法的效果分析
CRISPR-Cas技术的出现显著推动了基因敲除（KO）方法在CHO细胞工程中的应用。数据分析表明，KO方法的中位改善倍数（1.8倍）高于过表达（OEX，1.6倍）和基因敲低（KD，1.6倍），但统计上未显示出决定性差异。组合靶点工程策略显著优于单靶点策略，其中位改善倍数更高（1.75倍 vs 1.6倍），并且在报告≥5倍改善的顶级研究中，组合策略占比很高（40%）。此外，稳定的靶点工程通常比瞬时工程产生更高或相当的生产力改善。
靶点选择与生产力提升
工程化靶点所涉及的通路和细胞机制对改善程度有显著影响。针对表观遗传、通路组合以及凋亡/增殖的工程化努力获得了最高的中位改善倍数（分别为2.7倍、2.5倍和2.2倍）。在亚细胞定位方面，组合不同亚细胞定位的靶点、细胞膜定位和核内定位的靶点获得了高于整体中位数的改善倍数。分析还发现，CHO细胞工程用于抗体衍生物（如Fc融合蛋白、双特异性抗体）生产取得了显著成功，其中位改善倍数（2.7倍）高于整体中位数和mAb生产的改善倍数。关于在低产与高产CHO细胞中进行工程化的效果，数据显示在低生产者中观察到的中位改善倍数（2.5倍）高于高生产者（1.8倍），但差异未达到统计学显著性。
讨论与展望
本系统性综述汇编并分析了2011年以来关于CHO细胞工程方法的出版物，通过对466个工程化靶点的关键性能数据提取，形成了一个全面的数据集，从而能够进行趋势分析并识别关键因素，为未来的CHO细胞工程方法提供指导。分析表明，组合靶点工程、针对核内（如表观遗传调节因子）和凋亡/增殖通路的干预是提高生产力的有效策略。
该领域面临的主要挑战包括研究报告的异质性，以及缺乏标准化的数据格式和实验模型系统，这阻碍了数据的可比性、可重复性和再利用。采用标准化报告格式和通用参考细胞系（如NIST CHO细胞系）将有助于促进交叉研究比较和数据重用。展望未来，组合CHO细胞工程、高通量筛选、组学指导的靶点发现以及人工智能（AI）驱动工具（如大型语言模型）的整合，为在CHO细胞中生产日益复杂的生物制药提供了一条通往更可预测、更高效和定制化策略的有前途的道路。实现这一潜力的关键在于采用标准化报告格式和实验模型系统，以促进交叉研究比较、数据重用和提高可转化性。
