《Metabolic Engineering》：Metabolic engineering of
Escherichia coli for the high-level production of putrescine
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微生物生产 Putrescine 的高效方法开发及工程菌株构建，通过适应性实验室进化增强大肠杆菌对 Putrescine 的耐受性，结合系统代谢工程优化磷烯醇式丙酮酸羧化酶基因表达、引入异源赖氨酸乙酰转移酶并敲除谷氨酸脱羧酶，最终实现连续发酵生产 72.7 g/L Putrescine，刷新现有最高记录。
Yoo-Sung Ko | Je Woong Kim | Alisher Nazarbekov | Gi Bae Kim | Sang Yup Lee
韩国科学技术院（KAIST）化学与生物分子工程系（BK21项目），代谢与生物分子工程国家研究实验室及系统代谢工程与系统医疗保健跨代合作实验室，大田34141
摘要
腐胺是一种重要的平台化学品，用于工程塑料的制造。为了支持可持续塑料产业的发展，利用可再生资源通过微生物生产腐胺受到了越来越多的关注。在这项研究中，我们报告了一种能够高效生产腐胺的工程化大肠杆菌（Escherichia coli）菌株的开发过程。为了克服腐胺的毒性带来的限制，之前开发的XQ52菌株（一种源自W3110的腐胺生产菌株）经过适应性实验室进化，得到了AXQ52菌株，该菌株在分批发酵中产生了61.7克/升的腐胺。这一产量超过了大肠杆菌的天然耐受阈值。AXQ52菌株的基因组测序揭示了在高浓度腐胺环境下改善细胞适应性的突变。通过精细调节磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的表达、引入异源鸟氨酸乙酰转移酶以及破坏谷氨酸脱羧酶，进一步提高了产量。最终工程化的菌株在简单碳源条件下实现了72.7克/升的腐胺产量，产率为0.25克/克葡萄糖，生产速率为1.28克/升/小时，这是迄今为止报道的最高微生物腐胺产量。
引言
腐胺（1,4-二氨基丁烷）是一种重要的商品化学品，广泛用于制药、表面活性剂的制造，特别是作为聚酰胺-4,6（PA46）和PA410等工程塑料合成的单体（Chae等人，2020年）。目前，工业上的腐胺生产依赖于石化路线，即向丙烯腈中添加氰化氢，随后将生成的琥珀腈进行氢化（Lammens等人，2011年）。然而，这一过程在苛刻的条件下进行，能耗较高，因此需要更可持续的替代方案。因此，多年来微生物生产腐胺一直备受关注。
腐胺可以通过两条主要途径自然生物合成：(i) 鸟氨酸的直接脱羧；(ii) 通过精氨酸的五步转化（Qian等人，2009年）。已经有多种微生物宿主被改造用于通过这些途径发酵生产腐胺。例如，Aureobasidium melanogenum通过途径(i)被改造，能够在分批发酵中从葡萄糖产生26.9克/升的腐胺（Kong等人，2022年）；同样，Corynebacterium crenatum通过途径(ii)被改造，能够在分批发酵中从葡萄糖产生41.5克/升的腐胺（Yang等人，2022年）。更多相关例子见近期综述（Chae等人，2020年；Wendisch等人，2018年）。
除了发酵之外，还探索了以精氨酸为底物的全细胞生物催化方法。最近，大肠杆菌被改造以过表达途径(ii)中的酶，从而在葡萄糖共喂食条件下从精氨酸产生26克/升的腐胺（Li等人，2021年）。在另一项研究中，一种过表达精氨酸酶和鸟氨酸脱羧酶的大肠杆菌菌株实现了精氨酸到鸟氨酸的两步转化，随后再转化为腐胺，使用葡萄糖作为共底物时产量达到76克/升（J. Wang等人，2024年）。然而，依赖氨基酸补充会增加生产成本并限制规模经济性。因此，开发能够直接从简单碳源高效生产腐胺的菌株对于可持续且经济可行的工业应用至关重要。
微生物生产腐胺的一个关键瓶颈是宿主菌株对高浓度腐胺的耐受性有限。像腐胺、尸胺和亚精胺这样的多胺具有多种生理作用，包括核酸和蛋白质合成、细菌细胞间信号传递以及保护细胞免受氧化损伤（Pegg，2013年）。然而，它们在高浓度下会具有毒性，损害蛋白质、DNA和其他细胞成分。例如，高浓度的细胞外腐胺会改变大肠杆菌外膜孔蛋白OmpC和OmpF的表面电荷，降低膜通透性并阻碍生长（Dela Vega和Delcour，1996年；Tkachenko等人，2006年）。因此，提高微生物宿主对腐胺的耐受性对于提高产量至关重要。
在我们之前的研究中，我们报道了使用两个质粒p15SpeC-S112SargF和pKK105SglnA开发的大肠杆菌XQ52菌株（W3110 ΔlacI ΔspeE ΔspeG ΔargI ΔpuuPA PargECBH::Ptrc PspeF::potE::Ptrc PargD::Ptrc PspeC::Ptrc ΔrpoS），通过合成调控小RNA（sRNA）在最佳水平上过表达编码鸟氨酸脱羧酶的speC基因，并敲低编码鸟氨酸氨基甲酰转移酶和谷氨酰胺合成酶的argF和glnA基因（Noh等人，2017年；Qian等人，2009年）。该菌株在分批发酵中从葡萄糖产生了42.3克/升的腐胺，产率为0.228克/克葡萄糖，生产速率为1.27克/升/小时。
在这项研究中，我们通过适应性实验室进化（ALE）和随后的系统代谢工程增强了XQ52菌株的生产能力。通过ALE提高了其耐受性，得到了AXQ52菌株，该菌株能够在超过大肠杆菌天然耐受限值的浓度下生产腐胺。全基因组测序揭示了有助于提高耐受性的有益突变。随后进一步通过优化代谢流和破坏竞争途径来提高腐胺产量。本研究展示了系统代谢工程在高效生产腐胺方面的成功应用（图1）。
细菌菌株
本研究中使用的菌株总结见表1。XQ52菌株（Qian等人，2009年）作为腐胺生产的基础菌株，而大肠杆菌DH5α主要用于克隆目的。C. glutamicum ATCC 13032被用作argJ和pyc基因的基因组来源。
质粒构建
本研究中使用的质粒总结见表1。本研究中使用的PCR引物列于表S1，由Genotech（韩国大田）合成。
基于单质粒的表达系统构建
在我们之前的研究（Noh等人，2017年）中，XQ52菌株被引入了两个质粒p15SpeC-S112SargF和pKK105SglnA，通过sRNA过表达speC基因并敲低argF和glnA基因。由于pKK105SglnA的唯一功能是抑制glnA基因，我们将glnA-sRNA cassette重新定位到p15SpeC-S112SargF质粒中，从而开发了一个单质粒系统。这一策略旨在减少质粒维护负担。
结论
在这项研究中，我们开发了一种代谢优化的大肠杆菌菌株，能够高效且经济地生产腐胺。鉴于腐胺对大肠杆菌的毒性，提高菌株的耐受性是实现高产量的关键步骤。最初尝试通过改造膜蛋白来提高耐受性未能成功，反而导致发酵产量下降。随后，我们对XQ52菌株应用了适应性实验室进化（ALE）。
Alisher Nazarbekov：研究、数据管理。Je Woong Kim：撰写初稿、数据分析、正式分析、数据管理。Sang Yup Lee：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。Gi Bae Kim：数据分析。Yoo-Sung Ko：撰写、审稿与编辑、撰写初稿、方法学设计、研究、数据分析、数据管理
Wang等人，2024年。
本研究的数据可应相应作者的要求提供。
作者声明没有竞争性财务利益。
本工作得到了韩国科学技术部支持的“下一代生物精炼厂微生物细胞工厂平台技术开发”项目（2022M3J5A1056117）的支持。此外，还得到了Hanwha Solution通过KAIST-Hanwha Solution未来技术研究所的资助。
