《Journal of Food Composition and Analysis》：A collaborative study to validate
in vitro assays for protein digestibility assessment using pH-drop and pH-stat methods
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为解决动物实验伦理限制和高成本对蛋白质质量评估的制约，研究人员开展国际协同研究验证pH-drop和pH-stat两种体外蛋白消化率测定方法。结果显示两种方法具有优异的重复性（RSDr=0.8-2.1%/0.5-4.8%）和再现性（RSDR=1.2-3.6%/1.1-4.9%），与文献报道的真实粪便蛋白消化率（TFPD）高度一致。该方法获AOCS官方认证，为食品配方开发提供简单、可靠、符合伦理的蛋白质消化率评估工具。
在全球人口持续增长和老龄化加剧的背景下，蛋白质作为维持人体组织生长、修复和功能的关键营养素，其供应保障面临严峻挑战。令人担忧的是，2019年全球蛋白质-能量营养不良病例高达1476万余例。随着食品工业对新型蛋白质资源开发需求的提升，如何准确评估蛋白质质量成为制约行业创新发展的瓶颈问题。
目前国际通行的蛋白质质量评估标准——蛋白质消化率校正氨基酸评分（PDCAAS）体系，其核心指标蛋白质消化率仍需通过大鼠生物测定法获取真实粪便蛋白消化率（TFPD）。这种传统的体内评估方法不仅面临动物伦理争议，还存在实验周期长、成本高昂、样品需求量大等局限性，尤其不利于食品制造商在研发阶段对新型蛋白质原料和加工工艺进行快速筛选。更矛盾的是，虽然植物基和替代蛋白企业出于伦理考量倾向于避免动物实验，但美国加拿大等国的法规仍要求使用动物实验数据支撑蛋白质含量声称，这在一定程度上抑制了蛋白质食品领域的创新活力。
为突破这一困境，由曼尼托巴大学James D. House教授牵头，九家实验室共同参与的国际协同研究，对两种静态体外蛋白质消化率测定方法——pH-drop法和pH-stat法进行了系统验证。研究成果正式发表于《Journal of Food Composition and Analysis》，并于2025年3月6日获得美国油化学家协会（AOCS）统一方法委员会批准为官方方法Ka 1a（pH-stat）和Ka 1b（pH-drop）。
研究团队采用标准化的协同验证方案，选取了12种具有代表性的动植物蛋白原料，包括酪蛋白、蛋清粉、脱脂乳粉、大豆蛋白分离物、生熟豆类等，全面评估两种方法在不同蛋白质基质中的适用性。关键技术方法主要包括：pH-drop法通过监测酶解过程中pH值的变化（下降幅度）间接反映蛋白质消化程度；pH-stat法则通过维持恒定pH（8.0）所需滴定碱液体积来量化消化率。所有参与实验室均使用统一配制的酶混合液（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和链霉菌蛋白酶），并严格按照标准化流程进行操作，确保数据可比性。
研究结果充分验证了两种方法的可靠性：
3.1. 异常值检测
异常值剔除后，各样品保留7-9个实验室的有效数据。pH-drop法对初始pH平衡步骤更为敏感，而pH-stat法基于滴定体积的计算方式使其对操作差异的耐受性更强。
3.2. 重复性
两种方法均表现出优异的实验室内重复性：pH-drop法的相对标准偏差（RSDr）为0.8-2.1%，pH-stat法为0.5-4.8%，表明在相同条件下结果高度一致。
3.3. 再现性
实验室间再现性同样令人满意：pH-drop法的RSDR为1.2-3.6%，pH-stat法为1.1-4.9%，满足方法学验证要求。
3.4. 方差分析
方差分析显示，样品间差异是变异主要来源（pH-drop法80.6%，pH-stat法91.2%），而实验室间差异贡献较小（2.8%和1.8%），证明方法能有效区分不同蛋白质的消化特性。
3.5. 蛋白质消化率
两种方法测得的蛋白质消化率呈现相似规律：动物蛋白（酪蛋白104.6-110.4%）和高纯度植物蛋白（豌豆蛋白分离物102.2-103.2%）消化率较高，而粗植物原料（生斑豆84.9%）消化率较低。烹饪处理显著提升斑豆消化率（生84.9%→熟94.2-96.8%），证实方法能捕捉加工对蛋白质消化性的影响。
Bland-Altman分析显示两种方法具有中等一致性（平均偏差-1.75%，95%一致性界限-10.74至7.24%），相关性分析表明强线性关联（r=0.93）。与文献TFPD值比较显示相似趋势，但对蛋清粉等特殊样品的消化率评估存在差异，提示可能需要方法特异性校正。
研究结论强调，pH-drop和pH-stat法作为经过协同研究验证的标准化工具，为食品配方开发提供了实用、经济、可靠的蛋白质消化率评估方案。虽然目前尚未能直接替代监管要求的动物实验，但作为筛选工具已显示出显著优势。特别是在当前蛋白质质量评估数据匮乏的背景下，这些方法有望促进更全面的蛋白质摄入质量评估，支持食品行业向更加可持续、伦理化的方向发展。
值得注意的是，现有方法仍使用动物源酶制剂，未来开发微生物源替代酶将有助于满足严格素食认证要求。与INFOGEST等复杂体外消化模型相比，pH基方法在保持足够预测性的同时，显著降低了操作复杂性，更适用于工业级高通量筛选。随着蛋白质质量评估体系向消化性必需氨基酸评分（DIAAS）演进，这些基础方法的标准化也为未来更精准的营养评估奠定了重要基础。
