维生素B12有助于雄性小鼠骨骼肌的氧化磷酸化能力

《The Journal of Nutrition》：Vitamin B12 supports skeletal muscle oxidative phosphorylation capacity in male mice

维生素B12缺乏导致小鼠骨骼肌mtDNA尿嘧啶积累及氧化磷酸化功能下降，补充B12可改善老年小鼠肌肉线粒体功能。摘要：研究采用Mtr+/-基因敲除小鼠模型和维生素B12缺乏饮食，结合补充实验，发现B12缺乏显著降低骨骼肌最大呼吸链容量和复杂I活性，并导致mtDNA尿嘧啶水平10倍升高。对老年小鼠进行B12注射补充后，腓肠肌复合物IV活性增加2倍。研究揭示了B12通过维持mtDNA完整性和氧化磷酸化功能延缓肌肉衰老的机制。

　　

路易莎·F·卡斯蒂略（Luisa F. Castillo）、卡塔琳娜·E·海登（Katarina E. Heyden）、阿比盖尔·R·威廉姆森（Abigail R. Williamson）、马文霞（Wenxia Ma）、奥尔加·V·马利谢娃（Olga V. Malysheva）、纳撒尼尔·M·瓦坎蒂（Nathaniel M. Vacanti）、安娜·E·塔尔阿克-梅塞尔（Anna E. Thalacker-Mercer）、玛莎·S·菲尔德（Martha S. Field）

康奈尔大学营养科学系，美国纽约伊萨卡

摘要

背景

维生素B12是叶酸介导的一碳代谢（FOCM）的辅因子，该代谢过程生成核苷酸（胸苷酸（dTMP）和嘌呤以及甲硫氨酸。胸苷酸（dTMP）的合成受到抑制会导致DNA中尿嘧啶的积累。

目的

本研究的目的是确定B12的可用性如何影响骨骼肌中线粒体DNA（mtDNA）的完整性和线粒体功能。我们在年轻成年小鼠中模拟了B12缺乏的情况，并通过肌肉注射B12来评估B12补充剂对骨骼肌与年龄相关变化的影响。

方法

雄性甲硫氨酸合成酶敲低（Mtr+/-）小鼠和野生型小鼠（Mtr+/+）在出生后七周内被分别喂食含有25 μg/kg维生素B12的AIN93G对照饮食（C组，n=8；Mtr+-组，n=9）或不含维生素B12的B12缺乏饮食（-B12组，n=9）。20-22个月大的雄性C57BL/6N小鼠首先适应AIN93G对照饮食四周，随后在两条后腿肌肉中每周接受生理盐水（载体对照，30 μL 0.9% NaCl，n=5）或B12（0.65 μg/30 μL 0.9% NaCl，n=6）注射，持续八周。研究指标包括最大耗氧率（OCR）、mtDNA中的尿嘧啶含量（mtDNA完整性的生物标志物）、mtDNA拷贝数以及线粒体质量。数据通过双向方差分析（two-way ANOVA）在Mtr+/-小鼠模型中进行分析，并通过t检验评估B12补充剂对老年小鼠的影响。

结果

Mtr+-组小鼠的前胫骨肌（TA）的最大呼吸能力比Mtr+/+组低50%（p=0.01）。-B12饮食使富含线粒体的肌肉（比目鱼肌、股四头肌和腓肠肌的线粒体部分）中复合物I的最大能力下降25%（p=0.02）。-B12饮食导致红色肌肉和腓肠肌中的mtDNA尿嘧啶含量增加了约10倍（p=0.04和p=0.001）。在老年小鼠中，肌肉注射B12后腓肠肌中复合物IV的活性增加了2倍（p=0.04）。

结论

B12缺乏饮食会导致mtDNA中尿嘧啶的积累，并损害骨骼肌的最大氧化能力。B12补充剂改善了老年小鼠腓肠肌中复合物IV的最大能力，这反映了与年龄相关的骨骼肌衰退现象。

引言

维生素B12（B12）缺乏症在老年人及素食者中尤为普遍（1）。由于B12在支持DNA合成中的作用，这种缺乏症通常表现为血液学和神经系统症状。B12是叶酸介导的一碳代谢（FOCM）所必需的辅因子，该代谢途径为核苷酸（胸苷酸（dTMP）和嘌呤的从头合成以及甲基供体的生成提供一碳基团（1）。体内仅有两种酶需要B12作为辅因子：甲基丙二酰辅酶A突变酶（MCM），它通过三羧酸循环参与氨基酸和脂肪酸的代谢，位于线粒体内；另一种是甲硫氨酸合成酶（MTR），属于FOCM的一部分，位于细胞质中（1）。

MTR需要B12和叶酸来催化同型半胱氨酸生成甲硫氨酸的过程。在这个两步反应中，5-甲基四氢叶酸（5-methyl-THF）向钴胺素（B12的一种形式）提供甲基，同时释放THF并生成甲基钴胺素（2）。甲基钴胺素随后将甲基提供给同型半胱氨酸以合成甲硫氨酸（2）。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）将5-甲基-THF转化为5-甲基-THF的过程是不可逆的，而唯一能够代谢5-甲基-THF并释放THF的酶是MTR（图1）（3）。在B12缺乏或MTR表达降低的情况下，叶酸会以5-甲基-THF的形式积累，从而减少其他叶酸辅因子（如THF和5,10-亚甲基-THF）的可用性，而这些辅因子对于核苷酸合成（包括DNA中的“T”碱基胸苷酸（dTMP）的合成是必需的（图1）。

当dTMP水平较低时，DNA聚合酶会错误地将尿嘧啶（“U”）碱基插入DNA中代替“T”（4）。尿嘧啶的错误插入会启动碱基切除修复机制，而在持续缺乏dTMP的情况下，会导致DNA双链断裂、复制叉停滞以及DNA不稳定（4）。叶酸依赖的dTMP合成发生在多个细胞区室（细胞质、细胞核和线粒体）中（5, 6）。FOCM功能障碍对DNA稳定性的影响主要在核DNA（nDNA）的背景下进行研究。然而，有证据表明，无论是通过饮食还是遗传因素导致的FOCM障碍，都会导致mtDNA和nDNA中尿嘧啶的积累（5, 7, 8）。

尽管mtDNA的体积相对较小（16.5 kb），但它编码了多种参与线粒体电子传递链复合体的蛋白质。这些蛋白质及其复合体的表达对于通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生细胞能量至关重要（9）。mtDNA的复制是线粒体生物发生的一个组成部分，其维持与线粒体功能密切相关（9）。已经证明，核苷酸合成（特别是从头合成的dTMP）发生在线粒体内，并且对维持mtDNA的完整性至关重要（6）。虽然mtDNA中尿嘧啶积累的功能后果尚不清楚，但我们的先前研究表明，mtDNA中的尿嘧啶与肝脏组织中的氧化磷酸化（OXPHOS）和能量产生受损有关（7, 8）。

线粒体功能障碍是衰老过程的一个公认特征（10, 11）。衰老伴随着线粒体生物发生的下降和氧化磷酸化活性的减弱（12, 13, 14）。在骨骼肌中，这些线粒体损伤表现为ATP供应减少、肌纤维维持能力下降以及氧化损伤增加（15）。B12缺乏同样与老年人肌肉无力、线粒体功能障碍和易出现虚弱相关结局有关（16, 17）。

为填补现有知识空白，本研究通过基因敲除小鼠中的B12依赖性Mtr酶并诱导饮食性B12缺乏，来探讨B12缺乏条件下mtDNA的完整性和线粒体功能。鉴于高能量需求和富含线粒体的组织特别容易受到线粒体功能障碍的影响，我们将分析重点放在骨骼肌上。我们假设饮食性B12缺乏会加剧Mtr+/-基因型的影响，而B12补充剂可能缓解与年龄相关的线粒体功能变化。

Mtr+/-小鼠的饲养和管理

如前所述（18），Mtr+/-小鼠模型经过超过10代的回交后与C57BL/6J小鼠杂交。雄性Mtr+/+和Mtr+-后代在三周大时被随机分配到两种规定的饮食中。选择雄性小鼠是为了避免因雌性发情周期造成的变异，并更准确地再现我们在其他C57Bl/6J背景模型中观察到的效果（7, 8）。这两种饮食均为基于AIN93G的对照饮食，其中含有25 μg/kg的维生素B12（Mtr+/+组，n=8；Mtr+-组，n=9）。

B12缺乏饮食会降低Mtr+/-小鼠模型中的血浆B12水平并升高甲基丙二酸（MMA）水平

在任何时间点，不同饮食组或Mtr基因型之间的小鼠体重均无差异（补充图1A）。通过Lactobacillus leichmannii微生物测定法测得的血浆维生素B12浓度在-B12饮食下降至对照水平的1/20（p=0.0001）（图S1B）。通过LC-MS/MS测得的血清甲基丙二酸（MMA）浓度在-B12饮食下增加了20%（p=0.0006）（图S1C）。这些生物标志物的变化表明...

讨论

本研究使用Mtr+/-小鼠模型来探讨FOCM功能障碍（以及饮食性B12缺乏）对线粒体功能和mtDNA完整性的影响。此外，我们还研究了B12补充剂是否可以缓解与年龄相关的线粒体功能下降。如前所述，只有两种酶需要B12：MTR和MCM。MCM底物过量产生的副产物MMA是诊断B12缺乏的经典标志物（1）。

作者声明

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家老龄化研究所（NIA）的支持，资助编号为P30 AG050886，资助对象为AET和MSF。KEH获得了国家国防科学与工程研究生奖学金（NDSEG）的支持。LFC获得了美国国立卫生研究院糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（NIDDK）的资助，资助编号为T32-DK007158。本文内容仅代表作者观点，不一定反映...

致谢

作者的具体职责如下：KEH、LFC、AET、MSF负责研究设计；KEH、LFC、ARW、WM、NMV、OVM负责实验实施和数据分析；KEH、LFC、ARW、WM、NMV、OVM、AET、MSF共同撰写论文；MSF对最终内容负主要责任；所有作者均阅读并批准了最终稿件。作者感谢康奈尔大学统计咨询部门在统计分析方面的协助，以及Ivan Keresztes在Exactive GC质谱仪使用方面的帮助。